冷冻电镜揭示苏云金芽孢杆菌F-ENA作为厚壁菌门广泛存在的芽孢附属纤维家族

本研究通过冷冻电镜技术首次解析了苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)芽孢生物膜中新型纤维状芽孢附属物(F-ENA)的结构与功能。研究人员发现这种由DUF4183蛋白家族构成的5纳米直径纤维通过胶原蛋白F-Anchor锚定于外孢子膜，末端带有柔性纤维尖端F-BclA，揭示了其在芽孢聚集和生物膜形成中的关键作用。该研究不仅拓展了对芽孢表面结构的认知，还为开发新型生物农药提供了分子基础。

　　

在农业病虫害防治领域，苏云金芽孢杆菌(Bt)作为生物农药已有百年应用历史，但其芽孢表面复杂结构的分子机制仍是未解之谜。传统认知中，Bt通过产生伴孢晶体毒素(Cry toxins)杀死昆虫幼虫，然而这些毒素在阳光下易降解，需要频繁施用。近年研究发现，Bt芽孢能形成类似生物膜的结构，其表面覆盖着神秘的蛋白质纤维网络——芽孢附属物(ENAs)，这些结构可能影响芽孢的环境适应性和聚集行为，但具体分子组成和功能机制尚不明确。

来自比利时布鲁塞尔自由大学(Vrije Universiteit Brussel)等机构的研究团队通过整合冷冻电镜(cryoEM)、AlphaFold3预测和X射线晶体学技术，首次揭示了新型纤维状芽孢附属物(F-ENA)的三维结构及其组装机制。研究发现F-ENA是厚壁菌门中广泛存在的一类单分子蛋白纤维，其独特的"钩-槽"组装模式和双极胶原蛋白修饰系统为理解芽孢表面结构进化提供了新视角。相关成果发表于《Nature Communications》。

研究采用冷冻电镜解析天然状态下的纤维结构，结合质谱鉴定关键组分，通过异源表达验证自组装特性。针对外孢子膜锚定机制，利用X射线晶体学解析了ExsF/F-Anchor复合物结构；采用AlphaFold3预测蛋白互作网络；通过负染电镜观察芽孢聚集表型，并建立沉降实验定量分析纤维功能。

冷冻电镜鉴定Btk和Btb芽孢上的F-ENA纤维

通过负染电镜(nsTEM)观察到Bt亚种kurstaki(Btk)和berliner(Btb)芽孢表面存在直径5nm的柔性纤维，穿透30nm厚的"毛毡层"(hairy nap)，末端带有206±17nm(Btk)或82±6nm(Btb)的纤维尖端(fibrillum)。

Btk的F-ENA和S-ENA冷冻电镜结构

冷冻电镜以2.7?分辨率解析F-ENA为C3对称的螺旋结构，其基本单元为10kDa的DUF4183三聚体，通过N端钩肽(MPVIQPF)与相邻三聚体的疏水槽互锁。静电分析显示三聚体具有772±0.55D的轴向偶极矩，指导纤维定向生长。

两种胶原样蛋白将F-ENA锚定于外孢子膜并形成尖端纤维

遗传分析发现f-ena基因上游编码327个氨基酸的F-Anchor，其N端外孢子膜引导肽(9-37aa)通过ExsF三聚体锚定，中部含70个GXY胶原重复序列，C端为DUF4183结构域。AlphaFold3预测F-Anchor通过DUF4183结构域捕获F-ENA三聚体启动纤维组装。另一胶原蛋白F-BclA(701个胶原重复)通过N端IILPH基序与F-ENA结合，形成206nm的尖端纤维，其C端C1q结构域(与BclA-C有27.5%序列同一性)可能介导芽孢间相互作用。

F-ENA促进芽孢聚集

沉降实验显示野生型Bt407芽孢比F-ENA缺失株沉降快3倍。电镜观察到芽孢间由F-ENA/S-ENA纤维网络连接的"线性列车"结构，表明纤维通过F-BclA介导的异嗜性相互作用促进聚集。

Paenibacillaceae中F-ENA-2纤维的冷冻电镜分析

在Paenibacillus sp.中发现新型F-ENA-2纤维(3nm直径)，其DUF4183结构域通过95?长的β-桶状颈部延伸形成"串珠"外观， helical参数(上升95.25?，扭转67.50°)显著不同于F-ENA。

厌氧梭菌产生F-ENA-3a纤维

在Anaerovoracaceae科梭菌中鉴定出F-ENA-3a纤维(71.2?上升，74.4°扭转)，其DUF4183三聚体间通过6链β-桶连接，8个苏/丝氨酸位点可能存在O-糖基化修饰。

该研究系统揭示了芽孢附属纤维的分子多样性，建立了"外孢子膜锚定-纤维延伸-尖端修饰"的三元组装范式。F-ENA通过保守的DUF4183折叠和创新的N端钩机制实现稳定聚合，其长度多态性由胶原蛋白重复数精确调控。研究发现不仅拓展了对芽孢表面结构的认知，其揭示的纤维自组装原理为设计新型生物材料提供了蓝图。在应用层面，F-ENA介导的芽孢聚集可能影响生物农药的持效期和感染效率，针对这些纤维的改造有望开发出新一代环境适应性更强的Bt制剂。