烟草TOE3蛋白翻译后修饰通过磷酸化-泛素化协同调控抗病毒免疫的分子机制

这篇研究揭示了烟草中AP2转录因子TOE3通过磷酸化（CK2αL介导）和泛素化（FBXL1介导）的协同调控机制，显著增强植物对烟草花叶病毒（TMV）的抗性。研究发现CK2αL磷酸化TOE3的S58/T128位点可降低其与E3泛素连接酶FBXL1的亲和力，从而抑制26S蛋白酶体降解途径，稳定TOE3蛋白并激活防御基因表达。该成果为作物抗病毒育种提供了新靶点。

　　

1 引言

病毒病害严重威胁作物生产，其中烟草花叶病毒（TMV）能侵染36科400余种植物。植物通过转录因子（TF）调控防御基因表达抵抗病毒，AP2/ERF家族的TOE3是近年发现的抗病毒关键调控因子。然而，TOE3的翻译后修饰（PTM）机制尚不明确。

2 结果

2.1 CK2αL与TOE3互作

酵母双杂交（Y2H）筛选发现酪蛋白激酶IIα亚基类似蛋白（CK2αL）与TOE3相互作用。体外pull-down、双分子荧光互补（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）实验证实二者在烟草细胞核内直接结合。值得注意的是，CK2αL不与其他CK2亚基互作，提示其可能独立磷酸化TOE3。

2.2 CK2αL磷酸化TOE3关键位点

Phos-tag凝胶电泳和质谱分析鉴定出S58和T128是CK2αL介导的磷酸化位点。S58在茄科作物中高度保守，暗示其功能重要性。体内外激酶实验显示，TOE3^AA（模拟非磷酸化）的磷酸化信号消失，而TOE3^DD（模拟磷酸化）在TMV感染后稳定性显著提升。

2.3 磷酸化增强TOE3稳定性

在CK2αL过表达株系（CK2αL-OE）中，TOE3半衰期延长；而CK2αL敲低株系（Ri-CK2αL）中TOE3降解加速。有趣的是，磷酸化不改变TOE3的核定位或对下游基因（如KL1）的转录激活能力，但能抵抗FBXL1介导的降解。

2.4 CK2αL提升烟草抗病毒性

CK2αL-OE植株接种TMV后，系统叶片出现更多绿色恢复组织，病毒外壳蛋白（CP）积累减少50%。防御基因（MLP43、PR-4A等）表达上调，且与TOE3-OE表型一致。遗传互补实验证实TOE3位于CK2αL下游。

2.5 FBXL1泛素化降解TOE3

Y2H筛选发现F-box蛋白FBXL1与TOE3互作。体外泛素化实验显示，FBXL1通过SCF^FBXL1复合体催化TOE3的K48连接多聚泛素化，促进26S蛋白酶体降解。FBXL1-OE植株中TOE3降解速率提高2倍，伴随TMV易感性增强。

2.6 磷酸化削弱FBXL1结合

竞争性实验表明，磷酸化TOE3^DD与FBXL1亲和力降低60%，其K48泛素化水平仅为TOE3^AA的1/3。共表达TMV-GFP时，TOE3^DD能抵抗FBXL1介导的降解，使病毒复制减少70%。

3 讨论

该研究首次揭示TOE3通过"磷酸化-去泛素化"开关调控抗病毒免疫的机制：TMV感染诱导CK2αL表达，磷酸化TOE3使其逃避FBXL1识别，进而稳定激活MLP43等广谱抗病毒基因。尽管TOE3过表达会降低抗旱性，但其在延缓植物相变和增产方面的价值为设计TMV诱导型启动子提供了思路。

研究还发现CK2αL不依赖典型CK2全酶即可磷酸化TOE3，拓展了对非经典CK2功能的认知。FBXL1对非磷酸化TOE3的偏好性选择，为开发抗病毒小分子抑制剂（如模拟磷酸化肽段）提供了理论依据。