Gb3通过调控成纤维细胞异质性影响烧伤创面愈合与瘢痕形成：HEXB-Gb3-FGF2轴机制研究

这篇研究通过整合时空组学、脂质组学和单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术，系统揭示了globotriaosylceramide (Gb3)在皮肤再生中的关键作用。研究发现浅二度烧伤(SSDB)中Gb3生物合成显著上调，其关键合成酶hexosaminidase subunit beta (HEXB)通过激活FGF2信号通路抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化，从而减轻纤维化瘢痕形成。该研究为开发靶向抗纤维化疗法提供了新思路。

Abstract

皮肤成纤维细胞的异质性与伤口修复结果和纤维化进展存在机制性关联，其中鞘糖脂代谢成为生理性成纤维细胞多样性的关键决定因素。通过整合时空组学、脂质组学和单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析，结合临床标本的组织学评估，系统研究了globotriaosylceramide (Gb3)在真皮再生过程中的功能参与。比较分析显示，与深二度烧伤(DSDB)相比，浅二度烧伤(SSDB)中Gb3生物合成显著上调。研究发现hexosaminidase subunit beta (HEXB)是区分这两种损伤亚型的唯一差异表达Gb3合成酶。通过体外和体内模型的功能验证表明，药物抑制HEXB介导的Gb3合成会加剧成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化，减弱成纤维细胞生长因子2(FGF2)信号转导，最终促进纤维化瘢痕形成。这些发现建立了一个新的HEXB-Gb3-FGF2调控轴，该轴控制不同深度皮肤损伤中成纤维细胞的表型可塑性，为开发靶向抗纤维化疗法提供了机制性见解。

Graphical Abstract

在浅二度烧伤创面中，Gb3通过FGF2信号通路激活与乳头状细胞相关的基因。这增强了细胞分解纤维蛋白的能力并减少纤维化，最终防止烧伤损伤后瘢痕形成。而深二度烧伤创面则增强了细胞的纤维化能力，导致增生性瘢痕的形成。

1 Introduction

烧伤是全球主要的健康负担，WHO数据显示每年死亡病例超过180000例。根据深度和大小分类，不同厚度的真皮损伤，特别是二度烧伤(SDB)在门诊患者中最为常见。SDB进一步分为仅涉及真皮乳头层的浅二度烧伤(SSDB)和延伸至真皮乳头层和网状层的深二度烧伤(DSDB)。DSDB常进展为病理性伤口愈合伴增生性瘢痕形成，而SSDB往往预后较好。

脂质代谢在瘢痕疙瘩形成中普遍存在，如花生四烯酸水平升高是瘢痕疙瘩的显著特征。除了作为皮肤的关键成分外，脂质还作为第二信使的来源，如神经酰胺可影响参与瘢痕疙瘩形成的细胞过程。鞘糖脂(GSLs)是生物膜的重要组成成分，由一个神经酰胺骨架连接到一个聚糖部分。根据聚糖头基的丰度，GSLs可分为神经节系列(GM/GT/GD)、球系列(Gb)、乳糖系列(LC)和无唾液酸系列(GA)。Laura Capolupo等人在最新研究中阐明了Gb合成对真皮成纤维细胞异质性的影响，发现成纤维细胞特性部分由其膜上富集的Gb或GM通过成纤维细胞生长因子2(FGF2)信号通路决定。

2 Results

2.1 Gb在DSDB和SSDB中差异表达

通过空间转录组学(ST)分析评估DSDB和SSDB之间Gb代谢的深度依赖性变化。在烧伤后19天的代表性烧伤标本中，组织学确认的SSDB区域(灰色标记区域)在上象限显示完全再上皮化，而DSDB区域(黑色标记的下象限)则持续存在上皮缺损。基因集变异分析(GSVA)用于代谢通路活性的空间可视化，发现鞘脂代谢在DSDB区域的基因表达强度和空间分布显著高于SSDB区域。

靶向极性脂质代谢组学分析显示，SSDB和DSDB患者皮肤样本中Gb3水平存在显著差异。火山图和柱状图分析证实，SSDB中Gb3水平显著增加。免疫荧光染色显示，与SSDB创面相比，DSDB创面中Gb3水平显著降低。

2.2 Gb主要分布在真皮乳头成纤维细胞中

空间代谢组学分析显示，Gb主要定位于小而梭形的乳头状成纤维细胞(白色箭头)中，而非大而星状的回网状成纤维细胞，具有统计学显著的空间定位。单细胞RNA测序分析鉴定了9种细胞亚型，定量代谢分析确定了49条代谢通路的差异活性。Gb生物合成代谢通路的活性在SSDB和DSDB之间存在显著差异，而GM和LC在两种SDB分级间无显著差异。

2.3 Gb合成相关基因HEXB在DSDB和SSDB真皮中表达存在时间差异

从先前鉴定的9种细胞类型中提取成纤维细胞进行进一步分析，鉴定了11个成纤维细胞亚群。检测到DSDB和SSDB组间成纤维细胞中有6378个差异表达基因(DEGs)，与15个GbRGs交叉后产生6个重叠的差异表达GbRGs，包括HEXB、A4GALT、ST3GAL1、GLA、GBGT1和ST3GAL2。HEXB是DSDB和SSDB之间差异最显著的GbRG。

2.4 HEXB改变导致成纤维细胞中Gb3的同向改变并影响细胞异质性

研究发现，HEXB过表达(HEXB^OE)显著增加了dHFBs中Gb3水平，同时增加了FAP+CD90-乳头状成纤维细胞数量。Western blot和qRT-PCR显示，HEXB过表达后乳头状成纤维细胞标志物(如MMP1)表达增加，而网状成纤维细胞标志物(如ACTA2)表达减少。功能实验表明，HEXB^OE dHFBs的增殖和迁移能力增强，符合乳头状成纤维细胞特性。

2.5 Gb3加速伤口闭合并改善愈合质量

动物实验建立了Sprague-Dawley大鼠烧伤模型。Gb3组在烧伤后第13天率先完成再上皮化，而HEXB抑制剂组在烧伤后第13天未完成上皮化。Masson三色染色和天狼星红染色显示，Gb3组真皮厚度和胶原体积与正常皮肤相似，表明Gb3增加了肉芽组织重塑，从而减少了瘢痕组织的形成。

2.6 Gb3通过FGF2信号通路调控dHFBs的细胞异质性

相关性分析显示，FGF2-FGFR信号通路与HEXB表达呈正相关。Western blot和qRT-PCR技术评估了HEXB^OE和shHEXB细胞中FGF2的表达水平，发现FGF2和HEXB水平变化一致。FGF2下游效应物的分析表明，Gb3的存在可以影响它们的表达。

2.7 Gb3通过FGFR1结合调控dHFBs的细胞异质性

分子对接模拟确定了Gb3和FGFR1之间的强相互作用，Gb3与残基Gln209、Asp129、Trp211和Lys173之间形成氢键。研究发现FGFR1抑制逆转了Gb3诱导的dHFBs中下游效应物的上调。

3 Discussion and Conclusion

烧伤导致患者毁容、残疾甚至死亡，给患者及其家人带来巨大的经济和心理负担。虽然患者接受了最佳治疗，但愈合伤口常形成增生性瘢痕，导致毁容和功能障碍。本研究通过Stereo-seq评估正常皮肤、DSDB和SSDB伤口临床样本，发现DSDB和SSDB之间Gb合成存在差异。空间代谢组学结合scRNA-seq分析揭示，包括HEXB、HEXA、ST3GAL2和A4GALT在内的GbRGs主要在增殖性和纤维溶解性成纤维细胞表型中表达，而非网状成纤维细胞。

总之，通过整合生物信息学分析与细胞和动物实验，揭示了GSL代谢与SDB中成纤维细胞表型变化之间的联系。Gb3生物合成的多样性，特别是DSDB和SSDB之间的差异，导致成纤维细胞异质性。在SSDB中，Gb3相关基因HEXB的表达增加。随后，HEXB促进Gb3的合成，然后通过FGFR1激活FGF2信号通路，增强成纤维细胞的增殖和纤维溶解能力，最终促进成纤维细胞向乳头状亚型分化。