单细胞分析揭示铜绿假单胞菌中c-di-GMP协调毒力因子与生活方式转换的分子机制

本研究通过单细胞FRET显微技术解析了铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中第二信使c-di-GMP如何调控III型分泌系统(T3SS)与VI型分泌系统(T6SS)的异质性表达。研究发现高c-di-GMP水平通过抑制T3SS组装与效应蛋白分泌，同时促进H1-T6SS活性，揭示了病原体在运动-生物膜生活方式转换过程中毒力调控的新范式，为理解慢性感染机制提供新视角。

铜绿假单胞菌作为临床常见的革兰氏阴性机会致病菌，其多重耐药性和复杂毒力机制给临床治疗带来巨大挑战。这种病原体通过III型分泌系统(T3SS)直接注射效应蛋白破坏宿主细胞，同时利用VI型分泌系统(T6SS)进行细菌间竞争。更棘手的是，它能在自由运动状态和生物膜状态间灵活转换，形成急性或慢性感染。然而，这两种截然不同的感染模式如何协调？作为"细菌通用货币"的环二鸟苷酸(c-di-GMP)在其中扮演什么角色？这些关键问题长期困扰着微生物学家。

德国马克斯·普朗克研究所的研究团队在《Communications Biology》发表的研究中，创新性地采用单细胞FRET显微技术，结合分子生物学和蛋白质组学方法，系统解析了c-di-GMP对铜绿假单胞菌毒力系统的精细调控。研究人员构建了EGFP-SctQ标记的T3SS报告系统和TssB1-mCherry标记的T6SS可视化工具，通过代谢组学定量效应蛋白分泌，并开发新型c-di-GMP生物传感器实现单细胞水平信号分子动态监测。

c-di-GMP对分泌系统的差异性调控

通过比较不同c-di-GMP背景菌株发现，高c-di-GMP使每个细胞的T3SS注射器数量从4.58个降至3.86个，效应蛋白分泌量减少4倍；相反，H1-T6SS组装率显著提升，对竞争菌株的杀伤效率增强2倍。单细胞FRET显示T3SS活跃细胞的c-di-GMP水平显著低于非活跃细胞(Cohen's d=-0.57)，而T6SS活跃细胞则呈现相反趋势(d=0.60)。

毒力系统的单细胞互作网络

在ΔretS遗传背景下，仅4.7%细胞同时具有T3SS和T6SS活性，远低于理论随机分布值(11.3%)，证实二者存在显著拮抗。有趣的是，鞭毛与T3SS呈现协同关系，共现率达78.3%，而与T6SS共现率仅9.1%，揭示出"运动-攻击"与"定居-防御"两种截然不同的感染策略。

c-di-GMP作为调控枢纽的分子逻辑

研究发现T6SS活性可反向提升细胞内c-di-GMP水平，形成正反馈循环。这种双向调控网络解释了为何铜绿假单胞菌能快速适应环境变化：低c-di-GMP时，鞭毛驱动运动并激活T3SS利于宿主侵袭；高c-di-GMP时，T6SS增强促进生物膜形成和持续感染。

该研究首次在单细胞尺度描绘了铜绿假单胞菌毒力调控的全景图谱，突破传统群体水平研究的局限。发现的c-di-GMP-FleQ-T6SS调控轴为开发针对慢性感染的新疗法提供靶点，而毒力系统的"分工协作"策略启示我们：对抗这类"智能"病原体需采用多靶点联合干预策略。这些发现不仅适用于铜绿假单胞菌，也为研究其他革兰氏阴性菌的感染机制提供了范式参考。