基于CHO细胞定点整合系统的"难表达"单克隆抗体工业相关条件下表达评估研究

这篇综述创新性地应用CHO细胞杂交定点整合(SSI)系统，在工业相关条件下系统评估了10种治疗性单抗(mAbs)变体的表达特性。研究通过重组酶介导的盒式交换(RMCE)技术，在Rosa26和Dop1b两个基因位点构建等基因细胞池，揭示了单抗氨基酸序列变异导致的表达差异、结构稳定性变化和内质网应激(ER stress)特征，为单抗设计、候选分子筛选和工艺开发提供了重要指导。

　　

单克隆抗体工业化生产面临的"难表达"挑战

在生物制药领域，单克隆抗体(mAbs)持续占据主导地位，但不同序列变体在工业化生产平台中的表达差异成为重大挑战。传统随机整合(RI)系统存在克隆异质性问题，而瞬时表达又缺乏工业相关性。本研究创新性地采用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞为基础的杂交定点整合(SSI)系统，通过重组酶介导的盒式交换(RMCE)技术，在Rosa26和Dop1b两个基因组位点快速构建等基因细胞池，实现了工业相关条件下对"难表达"(DTE)单抗的系统评估。

定点整合系统的技术突破

该SSI系统采用"着陆垫"(LP)策略，在预选的基因组位点插入包含胸苷激酶(TK)基因和近红外荧光蛋白(emiRFP670)标记的构建体，通过Bxb1丝氨酸重组酶实现RMCE。这种设计可在1个月内完成等基因细胞池构建，显著提高了实验通量。研究团队建立了R26-C9和D1b-P1C11两个LP宿主细胞系，分别靶向Rosa26和Dop1b位点，通过Blasticidin S HCl筛选获得单拷贝整合的高表达克隆。

曲妥珠单抗变体的表达特征

研究选取了10个曲妥珠单抗变体（8个单氨基酸突变）在两个位点进行表达评估。批量培养结果显示，8个突变导致生产力(qP)降低，其中HC2(I34K)变体表达量最低，在Rosa26位点降低3倍，在Dop1b位点降低2倍。流加培养中，HC2、HC1(F67S)和LC2(V33K)三个变体仍保持低表达表型。值得注意的是，mRNA表达分析表明这些差异主要源于转录后瓶颈，而非转录水平变化。

分子机制的多维度解析

通过Western blot发现HC2变体几乎检测不到重链(HC)二聚体，提示组装障碍。内质网应激标记物分析显示：

• •

  PDI和GRP94在HC2池中显著上调

• •

  ERp57在HC2中表达最强

• •

  XBP1剪接体(XBP1s)在所有mAb生产池中上调，HC1变体尤为显著

  共聚焦显微镜观察未发现Russell小体形成，但HC染色强度存在细胞间差异。

热稳定性与结构关联

差示扫描荧光法(DSF)揭示了三种热转变模式：

1. 1.

   WT和LC3(P80I)：68.7-68.9°C和79.8-79.9°C双峰

2. 2.

   HC1和HC4(I51A)：主峰前移伴肩峰，T₂降低4.8-5.6°C

3. 3.

   LC1(F62S)、LC2和HC2：单峰伴长尾，仅能识别T₁

   LC2变体T₁最低(66.5°C)，提示Fab结构域显著 destabilization。

阿达木单抗变体的对比研究

相同突变在阿达木单抗中表现出不同模式：仅HC2(M34K)变体表达降低。有趣的是，流加培养中LC2和HC2变体反而呈现最高生产力，与曲妥珠单抗结果相反。转录分析显示HC:LC比例随培养时间增加，提示HC转录可能成为限制因素。

工业应用价值与科学意义

该研究首次在工业相关条件下系统评估了44种表达条件（10个变体×2个mAbs×2个位点），揭示了：

1. 1.

   特定位置突变(如HC-I34K)通过破坏氢键网络影响折叠

2. 2.

   芳香族残基突变(如HC-F67S)会扰动疏水核心

3. 3.

   结构不稳定与内质网应激激活存在明确关联

   这些发现为理性抗体设计提供了重要指导，SSI系统的发展将加速更多治疗性抗体的工业化进程。