菊花叶片衰老调控新机制：CmbHLH1L与CmNLP6/7L通过竞争结合CmbHLH63的分子互作网络

这篇研究揭示了菊花叶片衰老的核心调控机制：CmbHLH63通过招募转录抑制因子CmbHLH1L抑制下游基因CmNLP6/7L表达，而CmNLP6/7L作为转录激活因子通过竞争性结合解除抑制。研究发现CmbHLH1L的K140位点乙酰化修饰阻碍其核定位，从而精准调控叶片衰老进程，为作物抗衰育种提供新靶点。

　　

1 引言

叶片衰老是植物发育的关键环节，直接影响作物产量和观赏价值。菊花作为全球重要切花，叶片早衰导致重大经济损失。尽管NAC、WRKY等转录因子(TFs)在衰老中的作用已被阐明，但bHLH家族成员的调控机制仍不明确。本研究以菊花为模型，发现CmbHLH63通过形成CmbHLH1L-CmbHLH63-CmNLP6/7L三元复合物调控衰老进程。

2 结果

2.1 CmbHLH63促进叶片衰老

转录组分析发现CmbHLH63在衰老叶片中表达量骤降（Log₂FC=-7.43），但其过表达却加速衰老。乙烯处理实验证实CmbHLH63参与激素调控通路。亚细胞定位显示该蛋白定位于细胞核，符合转录因子特征。

2.2 CmbHLH63通过抑制CmNLP6/7L表达发挥作用

酵母双杂交和荧光素酶报告系统证实CmbHLH63无自主转录活性。嵌合激活实验（CmbHLH63-VP64）发现其通过遗传抑制下游靶基因发挥作用。ChIP-qPCR鉴定出CmNLP6/7L启动子区E-box（CANNTG）结合位点，该基因过表达可延缓衰老，其调控的叶绿体发育相关基因（CmHB52、CmVAR2等）表达变化与表型一致。

2.3 CmbHLH1L是CmbHLH63的协同抑制因子

酵母筛库鉴定出CmbHLH1L（与已报道CmbHLH1存在5个氨基酸差异）。Pull-down和Split-LUC实验验证二者互作。双分子荧光互补显示CmbHLH1L具有转录抑制活性，与CmbHLH63共表达时对CmNLP6/7L的抑制增强3.2倍。

2.4 CmNLP6/7L形成自激活反馈环

质谱分析发现CmNLP6/7L通过结合CmbHLH63解除抑制，形成正反馈调节。值得注意的是，该蛋白虽无典型DNA结合域，但能通过蛋白互作激活自身表达，这种非经典调控模式在植物中尚属首次报道。

2.5 乙酰化修饰调控CmbHLH1L核质穿梭

免疫共沉淀-质谱(IP-MS)鉴定出CmbHLH1L的K78、K81、K140三位点乙酰化修饰。其中K140乙酰化水平在衰老叶片中显著升高（2.3倍），点突变实验（K140R）证实该修饰阻碍核定位信号(NLS)功能，导致蛋白滞留细胞质。

3 讨论

该研究揭示了bHLH蛋白通过形成"抑制-激活"双功能复合物的精准调控机制：在衰老初期，核内CmbHLH1L-CmbHLH63复合物抑制CmNLP6/7L表达；随着衰老进程，CmbHLH1L乙酰化导致其核输出，解除对CmNLP6/7L的抑制，形成自我强化环路。这种动态平衡机制为理解植物衰老的时序调控提供了新视角。

4 材料与方法

实验采用菊花品种'Fendant'，通过VIGS病毒诱导基因沉默和TRV载体过表达构建转基因材料。蛋白质互作采用GST pull-down和Split-LUC双重验证。乙酰化修饰分析通过抗HA抗体免疫沉淀结合LC-MS/MS完成。所有统计采用单尾t检验（p<0.05）。

5 结论

本研究阐明乙酰化修饰通过调控CmbHLH1L亚细胞定位，影响其与CmNLP6/7L的竞争性结合，最终决定叶片衰老进程。该发现不仅完善了植物衰老调控理论，也为培育抗衰老花卉品种提供了分子靶标。