双链DNA稳定唾液中的双链RNA显著增强RNA干扰介导的褐飞虱基因沉默技术

这篇研究揭示了双链DNA（dsDNA）作为竞争性抑制剂，可显著抑制褐飞虱（Halyomorpha halys）唾液中的非特异性核酸酶（HhNSE）活性，从而保护双链RNA（dsRNA）免遭降解。通过体外实验和体内喂食试验，证实dsDNA-dsRNA混合配方能显著提升RNA干扰（RNAi）效率，为开发新型害虫防控策略提供了重要理论依据。

　　

双链DNA稳定唾液中的双链RNA显著增强RNA干扰介导的基因沉默

摘要

褐飞虱（Halyomorpha halys）作为入侵性农业害虫，对化学农药依赖的防控策略提出挑战。本研究聚焦RNA干扰（RNAi）技术，发现其效率受唾液DNA/RNA非特异性核酸酶（HhNSE）的严重制约。创新性地提出双链DNA（dsDNA）作为竞争性底物，可显著抑制HhNSE对双链RNA（dsRNA）的降解，从而提升靶基因沉默效果。

1 引言

RNAi技术因其物种特异性成为替代化学农药的研究热点，但效率在昆虫纲间差异显著。褐飞虱唾液和肠道中高表达的HhNSE可快速降解外源dsRNA，成为口服RNAi的主要障碍。研究假设dsDNA可通过竞争结合HhNSE保护dsRNA，并通过靶向网格蛋白重链基因（HhCHC）验证该策略。

2 结果

2.1 体外dsRNA稳定性分析

唾液实验显示，第四、五龄若虫及成虫唾液均能在10分钟内完全降解2 μg dsRNA（图1）。唾液腺提取物的降解速度更快（<1分钟），而血淋巴中dsRNA可稳定存在4小时（图2-3）。

2.2 核酸酶表达谱

RT-PCR证实HhNSE在唾液腺的表达量显著高于外切核糖核酸酶-1（HhEri-1）和小RNA降解酶-1（HhSDN-1）（图4），提示其主导作用。

2.3 dsDNA的竞争性抑制

246 bp的拟南芥dsDNA（dsDNA-AtACT）和102 bp的褐飞虱dsDNA（dsDNA-HhAGO2）均能剂量依赖性地延缓dsRNA降解（图5-6）。超纯鲑鱼精DNA（dsDNA-S）也表现出类似保护效果（图7）。

2.4 体内RNAi效率提升

口服dsRNA-CHC联合dsDNA-S使HhCHC表达降低至对照组的1/3（p=0.008），但注射dsRNA-CHC的基因沉默效果更强（6倍差异）（图8）。

2.5 死亡率差异

注射dsRNA-CHC导致93%死亡率（图9），而口服配方虽增强基因沉默却未显著提高死亡率，提示肠道吸收仍是限速步骤。

3 讨论

研究首次证实dsDNA可通过饱和HhNSE结合位点保护dsRNA，但肠道细胞摄取效率不足可能限制表型效应。与鳞翅目昆虫不同，褐飞虱可能缺乏系统性RNAi必需的SID-like蛋白。鲑鱼精DNA作为安全佐剂的潜力值得关注，但其生态风险需进一步评估。

4 结论

dsDNA配方可有效规避唾液核酸酶屏障，为褐飞虱RNAi防控提供新思路。未来需聚焦肠道细胞摄取机制优化，推动该技术向田间应用转化。

5 实验方法

采用唾液微量采集、RT-PCR定量和parafilm饲喂袋等创新技术，确保实验可重复性。统计模型（SAS 9.4）和双对数转化处理强化了数据可靠性。