RNA干扰技术靶向霜霉病病原体的双链RNA摄取与基因沉默机制研究

这篇综述系统评估了双链RNA（dsRNA）介导的RNA干扰（RNAi）在霜霉病（DM）防治中的应用潜力。研究通过靶向纤维素合成酶3（CesA3）和β-微管蛋白（BTUB）等保守基因，证实不同长度（21-75 bp）和浓度（1-5 μM）的dsRNA可显著抑制病原体孢子萌发和侵染，并通过共聚焦显微镜首次可视化Cy-5标记dsRNA在孢子内的摄取过程。该工作为开发精准、可持续的植物病害防控策略提供了重要理论依据。

　　

RNAi策略对抗霜霉病：dsRNA摄取与沉默机制解析

引言

霜霉病（Downy mildew, DM）由专性寄生卵菌引起，严重威胁全球农作物生产。传统防治手段有限，而RNA干扰（RNAi）技术通过双链RNA（dsRNA）介导的基因沉默展现出巨大潜力。研究选取拟南芥霜霉（Hyaloperonospora arabidopsidis, Hpa）、豌豆霜霉（Peronospora viciae f. sp. pisi, Pvp）和莴苣霜霉（Bremia lactucae, Bl）三种病原体，聚焦保守基因纤维素合成酶3（CesA3）和β-微管蛋白（BTUB），系统评估了dsRNA的防控效果。

靶向CesA3基因的跨物种沉默效应

通过序列比对发现，Hpa-CesA3与Pvp-CesA3、Bl-CesA3分别具有83%和81%的相似性。设计30 bp的短合成dsRNA（SS-dsRNA）后，体外萌发实验显示：≥30 bp的dsRNA可完全抑制孢子萌发，而21-25 bp dsRNA效果不稳定，其中25 bp dsRNA甚至使Hpa萌发率增加247.10%。在植物侵染实验中，30 bp CesA3-common dsRNA使Hpa和Pvp的孢子形成分别降低94%和100%，RT-qPCR证实目标基因表达量下降80%以上。

β-微管蛋白靶向验证

针对BTUB基因设计的30 bp dsRNA在三种病原体中均显著抑制孢子萌发（Hpa抑制率100%），且通过共聚焦显微镜观察到Cy-5标记的dsRNA在孢子内定位。有趣的是，dsRNA长度与沉默效率呈正相关：75 bp dsRNA处理后的豌豆叶片完全无病斑，而100 bp体外转录（IVT）dsRNA同样实现完全抑制。

dsRNA长度与浓度的调控规律

化学合成的21-25 bp dsRNA对Pvp萌发抑制率仅73%-77%，而30-75 bp dsRNA则完全阻断萌发。浓度实验揭示，5 μM dsRNA可使Hpa孢子萌发率降至0%，但1 μM处理时部分基因（如HpaG810056）的萌发率反升至283.43%。值得注意的是，大肠杆菌表达的285 bp长链dsRNA需经RNase III消化后才显现完全抑制效果，提示病原体对长链dsRNA的摄取存在限制。

多重靶向与长效沉默

同时靶向HpaG802064、HpaG802452和HpaG803108三个基因时，孢子萌发抑制呈现协同效应（三重靶向抑制率100%）。持续监测显示，5 μM SS-dsRNA处理后的HpaG809066基因表达在接种后4天下降94%，至11天仍保持53%的抑制率，证实沉默效果的持久性。

机制与应用前景

共聚焦成像直接捕捉到Cy-5-dsRNA在孢子及芽管内的分布，为dsRNA内化提供了可视化证据。研究同时指出，部分长链dsRNA可能因与非靶标植物基因的相似性引发叶片坏死，强调精准设计的重要性。这些发现为开发基于RNAi的广谱霜霉病生物农药奠定了理论基础，未来需结合纳米载体等技术优化田间应用的稳定性和递送效率。

（注：全文数据均源自原文实验，未添加主观推断）