基于新型Bacillus subtilis菌株MA6的α-淀粉酶绿色原位合成淀粉纳米颗粒：统计优化与表征研究

本研究针对传统物理化学法制备淀粉纳米颗粒(StNPs)的高成本、高能耗及环境风险问题，采用新分离的Bacillus subtilis strain-MA6（GenBank登录号ON840082）产α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)，通过Plackett-Burman设计(P-BD)和Box-Behnken设计(B-BD)优化培养基参数使酶活提升14.5倍，并首次实现酶法原位合成平均粒径43nm、zeta电位-15.1mV的球形StNPs。FTIR、DLS和HR-TEM表征证实该方法绿色高效，为食品医药领域纳米载体开发提供新策略。

　　

淀粉作为植物中储量最丰富的多糖之一，其纳米化改造在药物递送、食品乳化等领域展现出巨大潜力。然而传统物理化学法制备淀粉纳米颗粒(StNPs)面临双重困境：高压均质、酸水解等方法能耗高且易破坏淀粉结构，而化学交联又可能引入有毒试剂残留。更棘手的是，现有工艺难以精准控制纳米颗粒的粒径分布和稳定性——这些恰恰是决定StNPs功能性能的关键参数。

针对这一行业痛点，埃及国家研究中心（National Research Centre）纤维素与造纸系的Mohamed S. Hasanin与药物工业研究所的Mohamed A. A. Abdella另辟蹊径，从农业土壤中分离出一株产酶能力卓越的Bacillus subtilis strain-MA6（保藏号ON840082），其分泌的α-淀粉酶能特异性切断淀粉α-(1,4)糖苷键，通过温和的酶法水解实现淀粉绿色纳米化。这项发表于《Microbial Cell Factories》的研究，首次将统计优化与酶法纳米制备技术相结合，不仅大幅提升了酶产量，更开创了"发酵-纳米化"一体化生产新模式。

研究团队运用三项核心技术：①通过16S rRNA基因测序（引物27F/1492R）鉴定菌种；②采用Plackett-Burman设计筛选11种培养基成分的关键影响因子，再以Box-Behnken设计优化三核心参数（可溶性淀粉、MgSO₄、培养时间）；③借助动态光散射（DLS）、高分辨透射电镜（HR-TEM）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）多维度表征StNPs特性。

【α-淀粉酶生产优化】

通过P-BD从11个变量中锁定MgSO₄、可溶性淀粉和培养时间为显著影响因子，模型确定系数R²=0.9990。B-BD二次模型进一步优化显示：当淀粉0.52%、MgSO₄ 0.4%、培养120小时时，酶活达861.2 U/mL，较基础培养基提升14.5倍。值得注意的是，淀粉浓度与酶活呈负相关，暗示底物抑制效应。

【StNPs表征】

选取酶活梯度样本（T₅ 552.1 U/mL、T₇ 303.7 U/mL、T₁₃ 855.8 U/mL）进行分析：

• FTIR显示高酶活处理组（T₁₃）的O-H峰位移至3300 cm^-1，C=O峰红移至1617 cm^-1，证实酶解引起氢键网络重组

• DLS检测粒径从天然淀粉的3204 nm降至52.4±4 nm，zeta电位提升至-15.1±3.2 mV

• HR-TEM揭示T₁₃组形成单分散球形纳米颗粒（43 nm），而低酶活组存在明显团聚

【结论与意义】

该研究建立了微生物α-淀粉酶原位合成StNPs的创新方法，突破性地发现酶浓度与纳米颗粒稳定性呈正相关（r=0.92）。相比传统方法，该工艺具有三重优势：①利用统计模型精准控制酶解程度；②省去后续纳米化处理步骤；③产物无有害试剂残留。特别值得注意的是，研究揭示淀粉链的断裂程度直接影响StNPs的结晶度——这一发现为定制化设计功能型纳米淀粉提供了理论依据。未来通过定向进化改造α-淀粉酶活性中心，有望实现StNPs粒径的精准调控，推动其在靶向给药和可食用包装膜中的应用。