NMOSD与MOG-AD的炎症特征及临床差异：基于比较分析的蛋白质组学新发现

本研究针对骨组织蛋白质组学分析中存在的基质复杂、胶原干扰等技术难题，开发了一种快速两步提取方案。研究人员通过系统比较酶解胶原与分步提取策略，建立了兼容代谢组学的优化流程，在保留4,518种蛋白定量能力的同时将处理时间缩短50%，为骨代谢疾病机制研究和治疗开发提供了高效技术平台。

　　

骨骼作为人体最坚硬的器官，其复杂的矿化基质却给科学家们带来了意想不到的烦恼。骨组织中高达70%的羟基磷灰石和占有机成分90%的胶原蛋白，就像一层层厚重的"盔甲"，将那些调控骨代谢的关键信号分子和生长因子深埋其中。这些低丰度蛋白对理解骨质疏松、骨折愈合等生理病理过程至关重要，但传统提取方法要么被胶原蛋白"喧宾夺主"，要么需要长达4天的繁琐步骤，严重制约着骨生物学研究的进展。

德国弗劳恩霍夫细胞治疗与免疫学研究所（Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology）的研究团队在《Journal of Proteome Research》发表了一项突破性研究。他们开发出新型两步提取方案，仅用一半时间就实现了4,518种蛋白质的定量分析，动态范围跨越4个数量级，为骨组织多组学研究树立了新标准。

研究采用冷冻研磨的Wistar大鼠股骨样本，通过酸性（1M HCl）和变性（6M GuHCl）缓冲液两步顺序提取，结合氯仿-甲醇代谢物共提取策略。所有样本均在timsTOF Pro 2质谱仪上采用数据非依赖采集并行累积串行碎裂（diaPASEF）模式分析，使用DIA-NN软件进行数据库匹配和定量分析。

系统评估不同方案的性能

比较五种提取方法显示，新开发的两步法（2-step）在4,518个定量蛋白数量上接近四步法（4-step）的91%，但处理时间缩短50%。引人注目的是，胶原酶处理法（1-step + C）虽降低I型胶原含量，但定量蛋白数仅为两步法的60%。

可变蛋白提取效率

四步法以610μg总蛋白产量居首，但两步法通过优化提取缓冲液，在保持329μg产量的同时显著提升检测灵敏度。酸溶性（AS）和酸不溶性（AI）分步提取策略使蛋白动态范围突破10⁴倍。

胶原蛋白含量分析

创新的是，无需胶原酶处理，两步法通过pH调控就使Col1a1的丰度排名从常规的第4-7位降至第65位。AS/AI分步提取还能选择性富集不同等电点的胶原亚型，如AS组分中pI 9.39的Col1a2占比显著提升。

代谢组学兼容性验证

整合代谢物提取的2-step + M方案仍保持4,393个蛋白定量能力，技术重复间变异系数（CV）低至14.8%。尽管氯仿-甲醇处理使AS组分中>60kDa蛋白占比增加，但AI组分成功补偿了这部分损失。

这项研究建立的标准化流程解决了骨蛋白质组学的三大痛点：首次实现48小时内完成从样本到数据的全流程；突破性将代谢物与蛋白质共提取的损失率控制在15%以内；通过智能分步策略将胶原干扰降低到质谱可接受范围。尤为重要的是，方案在德国实验室间重复验证显示，78%的蛋白能在所有技术重复中稳定检出，为全球骨研究提供了可推广的技术范本。研究者特别指出，该流程对临床骨活检样本同样适用，未来可加速骨质疏松药物靶点筛选和骨肿瘤标志物发现。