动态度量揭示着丝粒蛋白周期重塑规律——人类染色体分离的分子调控新机制

本研究通过定量免疫荧光技术(qIF)系统描绘了32种着丝粒蛋白和5种有丝分裂激酶底物在整个细胞周期中的动态变化，揭示了着丝粒架构的多阶段组装机制。研究人员发现CCAN蛋白在S期快速招募到新生着丝粒，Mis12C在G1期通过CENP-C依赖但Aurora B非依赖的方式定位，而Knl1C和Ndc80C的招募始于晚S期。该研究为理解染色体精确分离的分子协调机制提供了全景式视角，对肿瘤等染色体数目异常疾病的机制研究具有重要意义。

　　

染色体精确分离是细胞分裂的核心事件，其错误会导致肿瘤等疾病的典型特征——非整倍体。作为染色体分离的"指挥中心"，着丝粒(kinetochore)由100多种蛋白质组成复杂动态结构，但长期以来科学家对其组装时序和调控机制缺乏系统认识。传统研究多聚焦有丝分裂期，而对G1/S/G2等间期阶段的着丝粒"前体"(pre-kinetochore)变化知之甚少，这严重限制了对染色体分离全周期调控的理解。

威斯康星大学麦迪逊分校(University of Wisconsin-Madison)的研究团队在《Nature Communications》发表突破性成果。他们开发了精确定量免疫荧光技术(qIF)，首次系统描绘了32种着丝粒蛋白和5种激酶底物在整个细胞周期的动态图谱。研究发现CCAN内着丝粒蛋白在S期DNA复制后立即被招募到新生着丝粒；意外发现Mis12复合体(Mis12C)早在G1中期就通过CENP-C依赖但Aurora B非依赖的途径定位；而Knl1复合体(Knl1C)和Ndc80复合体(Ndc80C)的组装始于晚S期。这些发现彻底改变了对着丝粒组装传统认知，为染色体稳定性维持机制提供了全新框架。

研究采用定量免疫荧光显微镜技术，通过细胞周期阶段特异性标志物(CENP-F、PCNA等)精确区分各时期细胞，结合局部背景校正算法实现单着丝粒蛋白定量。针对37种蛋白/磷酸化位点优化抗体标记方案，信噪比(S/N)最高达10倍以上。通过药物处理(如Aurora B抑制剂ZM447439)和条件性降解系统(Dsn1-AID)验证蛋白功能。

结果

着丝粒蛋白定量策略

建立基于CENP-F/PCNA/DAPI的细胞周期鉴定体系，将间期细分为G1、早S、晚S和G2期。采用甲醇或PFA固定避免蛋白解离，通过双框局部背景扣除法实现单着丝粒精确定量。

CENP-A与CENP-B动态

CENP-A(着丝粒特异性组蛋白变体)在G1/S期达峰，S期后减半，证实其仅在G1早期装载。CENP-B在G2期增加，可能与着丝粒DNA合成相关，并在中期达峰。

CCAN复合体动态

所有CCAN组分在S期快速招募到新生着丝粒。CENP-C水平从间期到前中期持续增加，可能受Cdk1磷酸化调控；CENP-N/I/K则随有丝分裂进展逐渐减少，反映CENP-N对开放染色质的偏好。

KMN网络组装

Mis12C亚基(Dsn1/Pmf1等)在G1期即出现，形成稳定异源四聚体。Knl1C和Ndc80C在晚S期开始招募，分别在前中期和中期达峰，提示需要额外翻译后修饰(PTMs)才能与Mis12C结合。

冠状区/SAC蛋白动态

Bub1/Bub3在前中期达峰，BubR1招募略有延迟。Mad1/Mad2在前中期瞬时出现，RZZ复合体(含Zw10)需核膜破裂后进入。CENP-E(驱动染色体整列的驱动蛋白)和CENP-F分别依赖微管结合和Bub1招募，展现不同的时空模式。

激酶调控网络

Sgo1通过Bub1介导的H2A-T120磷酸化(pH2A-T120)定位于着丝粒，前中期达峰。Aurora B从G2期开始定位，其底物CENP-A-S7磷酸化(pCENP-A-S7)在前期即达最大水平。Plk1在G2期出现，前中期达峰。

Ska与Astrin-SKAP复合体

Ska复合体(微管结合传感器)在前中期即完全招募，而张力传感器Astrin-SKAP仅在中期双取向染色体上出现。药物实验证实Astrin招募需要微管结合和局部Aurora B活性降低。

CENP-C主导Mis12C间期招募

CENP-C降解实验显示其是Mis12C间期定位的主要适配体，而Aurora B活性对此过程非必需，揭示与有丝分裂期不同的调控机制。

结论与意义

该研究首次绘制了人类着丝粒架构的全周期动态图谱，揭示其组装遵循严格层级：CCAN构成永久核心，Mis12C在G1期奠定基础，Knl1C/Ndc80C在晚S期加入，SAC和冠状蛋白在前中期动态变化。特别重要的是发现着丝粒张力感知存在两个层级——Ska复合体响应微管结合，而Astrin-SKAP需要张力形成。这些发现不仅解决了着丝粒研究领域长期存在的时序争议，更为非整倍体疾病机制和抗癌药物研发提供了新靶点。研究建立的qIF平台为超大分子复合体的动态研究树立了新范式。