胰腺癌CAR-T细胞耐药机制的临床与分子解析：靶向ID3/SOX4双敲除增强抗肿瘤持久性

本研究针对胰腺导管腺癌(PDAC)中CAR-T细胞疗法响应率低的临床难题，通过I期临床试验结合单细胞测序技术，首次揭示了患者CAR-T细胞中ID3/SOX4转录因子的上调与功能障碍的关联。宾夕法尼亚大学团队创新性开发的双基因敲除CAR-T细胞在小鼠模型中展现出显著延长的无复发生存期，为突破实体瘤免疫治疗瓶颈提供了新策略。论文发表于《Cell Reports Medicine》。

　　

胰腺癌作为"癌症之王"，其五年生存率长期徘徊在10%左右，其中胰腺导管腺癌(PDAC)占比高达90%。尽管嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法在血液肿瘤中取得突破，但在PDAC等实体瘤中却屡屡受挫——肿瘤微环境(TME)的免疫抑制、靶抗原异质性、T细胞浸润不足等问题形成多重屏障。更棘手的是，持续抗原刺激会导致CAR-T细胞出现功能耗竭(exhaustion)，表现为效应功能丧失和抑制性受体持续表达。间皮素(MSLN)作为PDAC过表达的肿瘤相关抗原，虽已成为CAR-T治疗的理想靶点，但前期临床试验显示抗MSLN CAR-T细胞仅能诱导疾病稳定而非完全缓解。这些临床困境凸显出解析CAR-T细胞耐药机制的紧迫性。

美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院(University of Pennsylvania Perelman School of Medicine)的研究团队在《Cell Reports Medicine》发表了一项突破性研究。该团队通过I期临床试验(NCT03323944)联合多组学分析，系统揭示了PDAC患者中huCART-meso细胞的动态变化规律，并创新性地通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建ID3/SOX4双敲除(DKO)CAR-T细胞，在临床前模型中成功延长了无复发生存期(RFS)。这项研究首次在人体水平证实了CAR-T细胞在PDAC微环境中的转录重编程特征，为克服实体瘤免疫治疗耐药提供了新思路。

研究采用多维度技术路线：首先对9例转移性PDAC患者进行静脉(intravenous, i.v.)、腹腔(intraperitoneal, i.p.)和肝动脉(intrahepatic, i.h.)三种给药方式的I期临床试验监测；通过流式细胞术和定量PCR(qPCR)分析患者血液、腹水及配对活检组织中的CAR-T细胞分布；运用单细胞RNA测序(scRNA-seq)解析肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的转录组特征；基于前期发现的30基因耗竭特征谱，采用CRISPR-Cas9构建ID3/SOX4单敲除和双敲除CAR-T细胞，并在人源化PDAC小鼠模型中评估抗肿瘤效果。所有临床试验样本均来自宾夕法尼亚大学医院系统，动物实验使用NSG免疫缺陷小鼠构建皮下移植瘤模型。

临床安全性验证但疗效有限

临床试验数据显示，三种给药途径的huCART-meso细胞治疗均表现出良好安全性，仅观察到1-2级细胞因子释放综合征(CRS)。但疗效方面，9例患者中仅1例达到短暂疾病稳定(SD)，其余均出现疾病进展(PD)。分子检测发现CAR-T细胞在肿瘤组织中的浸润率不足0.1%，且表面CAR表达显著下调，提示存在严重的 trafficking障碍和受体丢失现象。

单细胞图谱揭示耗竭特征

对患者腹水来源CAR-T细胞的scRNA-seq分析显示，这些细胞显著富集GZMK⁺效应记忆T细胞(Tem)亚群，并高表达PD-1(PDCD1)、CTLA-4等免疫检查点分子。尤为关键的是，研究人员发现这些细胞中19/30的耗竭特征基因(包括ID3和SOX4)显著上调，与体外慢性刺激模型高度一致。这为临床耐药提供了分子解释——肿瘤微环境诱导的转录重编程使CAR-T细胞进入功能失调状态。

双敲除策略突破治疗瓶颈

基于上述发现，研究团队构建了ID3/SOX4双敲除CAR-T细胞。在AsPC-1移植瘤模型中，DKO CAR-T细胞表现出显著延长的抗肿瘤活性：与野生型(WT)相比，DKO组的复发风险降低67%(HR=0.33, p<0.001)，且复发肿瘤体积缩小82%。机制研究表明，DKO能有效阻断CAR-T细胞向NK样耗竭亚群(NK-like Tex)的分化，维持GZMK⁺效应表型。值得注意的是，单敲除效果呈现供体依赖性差异，而DKO在所有测试供体中都表现出稳定增强。

这项研究开创性地将临床观察与基础研究相结合，首次在人体水平描绘了PDAC微环境中CAR-T细胞的动态演化图谱。其核心价值在于：① 鉴定出ID3/SOX4作为调控CAR-T细胞持久性的关键转录节点；② 证实双靶点干预比单基因敲除更具治疗优势；③ 为PDAC的联合免疫治疗提供新靶点。尤其值得注意的是，DKO策略没有增加毒性风险，这为后续临床转化奠定了安全基础。未来研究可探索DKO CAR-T细胞与PD-1抑制剂或CD40激动剂的联用方案，有望进一步突破免疫治疗瓶颈。该成果不仅为PDAC治疗带来新希望，其揭示的耗竭调控机制也可能惠及其他实体瘤的CAR-T疗法开发。