工程化RNase H3 N端杂合结合域enDR3：一种全基因组水平精准定位R-loop的新工具

本研究针对R-loop（RNA/DNA杂合体）检测技术存在的局限性，开发了基于细菌RNase H3 N端结构域改造的新型捕获工具enDR3。通过引入特异性氨基酸突变增强其对RNA/DNA hybrids的亲和力，研究人员成功将enDR3应用于DRIPc-seq和ChIP-seq技术体系，实现了体外与体内R-loop的一致性检测。该工具克服了传统S9.6抗体方法的局限性，为研究R-loop在基因组不稳定性和人类疾病中的作用提供了更可靠的解决方案。

　　

在基因组稳定性维持和基因表达调控中，三链核酸结构R-loop（由RNA/DNA杂合体和置换的单链DNA组成）扮演着双刃剑角色。虽然生理状态下R-loop参与转录调控等关键过程，但其异常积累会导致DNA损伤，与癌症、神经退行性疾病等密切相关。然而，现有检测技术如S9.6抗体免疫沉淀存在外源DNA污染风险，而基于人源RNase H1的体内检测方法可能干扰内源功能，这种技术壁垒严重阻碍了对R-loop生物学功能的深入解析。

波兰科学院生物化学与生物物理研究所（Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences）的Marta Jedynak-Slyvka等研究者通过蛋白质工程策略，将嗜热细菌Geobacillus stearothermophilus RNase H3的N端杂合结合域（Hybrid-Binding Domain, HBD）改造为串联双结构域enDR3，并引入L52M突变增强结合特异性。该团队同步开发了非结合突变体nb-enDR3作为内参对照，系统解决了现有技术缺乏标准化阴性对照的痛点。相关成果发表于《Nucleic Acids Research》。

研究采用荧光各向异性（Fluorescence Anisotropy, FA）和电泳迁移率变动分析（EMSA）验证enDR3的结合特性，通过DNA/RNA免疫沉淀-cDNA转化测序（DRIPc-seq）和染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）进行全基因组定位。特别构建了稳定表达enDR3-mEGFP的HeLa Flp-In细胞系，实现非交联条件下的天然R-loop捕获。

关键技术创新

1. 1.

   蛋白质工程改造：将RNase H3 N端结构域设计为串联双拷贝，通过L52M突变使RNA/DNA hybrid结合亲和力提升至K_d=91±10 nM，较野生型提高7倍

2. 2.

   双模式检测体系：首次实现同一捕获工具（enDR3）在体外（DRIPc-seq）和体内（ChIP-seq）的R-loop同步检测

3. 3.

   内源性对照设计：非结合突变体nb-enDR3（S48A/K50A）替代传统RNase H消化步骤，避免酶处理不完全导致的假阴性

主要研究发现

1. 1.

   分子水平特性：FA实验显示enDR3对20bp RNA/DNA hybrid的亲和力（K_d=91nM）与S9.6抗体相当（84nM），但对dsRNA/dsDNA的结合能力弱30-300倍，证实其高度特异性

2. 2.

   基因组分布特征：

   • •

     DRIPc-seq检测到19,373个R-loop峰，54.9%位于基因体区，25.6%靠近转录终止位点（TES）

   • •

     ChIP-seq发现73.1%峰集中在启动子区，与组蛋白标记H3K4me3/H3K27ac共定位，支持R-loop在转录起始调控中的作用

3. 3.

   技术对比优势：enDR3-DRIPc与S9.6-DRIPc的Bland-Altman分析显示95%一致性界限为[-0.29,0.28]，证实检测结果高度吻合

该研究通过创新性地划分R-loop为两类：启动子近端"Class I"（通过ChIP检测）和转录延伸相关"Class II"（通过DRIP检测），解决了长期存在的技术差异争议。实验证明enDR3能同时捕获两类R-loop，其中Class I富集于CpG岛等调控区域，Class II则与基因表达水平正相关。

这项研究的意义在于：

1. 1.

   提供了一种低成本、高稳定性的R-loop检测替代方案，其细菌表达系统避免了S9.6抗体的哺乳细胞污染风险

2. 2.

   建立的标准化内参体系为不同实验室数据比较提供基准

3. 3.

   双模式检测技术为阐明R-loop在生理病理过程中的动态变化奠定方法学基础

4. 4.

   发现启动子区R-loop与增强子元件的关联，为表观遗传调控研究开辟新视角

未来可进一步开发enDR3与CUT&Tag技术的联用方案，实现单细胞水平R-loop动态监测。该工具的应用将推动对神经退行性疾病、自身免疫疾病等R-loop相关疾病的机制解析。