时间分辨框架揭示mRNP加工与组装因子在转录位点的动态招募机制

本研究针对真核生物mRNP（信使核糖核蛋白）组装时空协调机制不明的关键问题，通过构建酿酒酵母基因阵列活细胞成像系统，首次定量揭示了Yra1、Cbp80和Yhs7等先驱因子在转录位点的动态招募规律。研究发现Yra1的早期定位独立于THO复合体，且依赖Cbp80及其RNA识别基序（RRM），为理解mRNP组装级联反应提供了全新时间框架。该成果发表于《Nucleic Acids Research》，为基因表达调控与神经退行性疾病相关机制研究奠定基础。

　　

在真核细胞中，mRNA的核质转运需要经历复杂的加工与包装过程形成信使核糖核蛋白（mRNP）颗粒。尽管mRNP组装对基因表达至关重要，但其在活细胞中的时空动态仍如"黑箱"。传统染色质免疫沉淀（ChIP）技术难以捕捉单细胞水平的异质性，而TREX复合体（包含THO、Yra1和Sub2）各组分的功能层级关系长期存在争议——究竟是THO复合体主导Yra1的招募，还是存在独立加载途径？这些机制空白严重制约着对RNA代谢异常相关疾病（如癌症和神经退行性疾病）的理解。

加州大学戴维斯分校葡萄栽培与酿酒学系（University of California, Davis）的Theresa Wechsler团队开发了突破性的活细胞成像策略。研究人员在酿酒酵母中构建了包含25个转录单元（TU）的诱导型基因阵列，通过lacO重复序列标记转录位点，结合内源性荧光标记蛋白追踪，首次实现了mRNP组装因子的时间分辨观测。该研究采用双启动子系统（pCUP1和Z₃EVpr）控制相同编码序列（GFA1），结合mRNP-SiMPull单分子成像和酵母双杂交等技术，绘制出蛋白质招募的精确时间图谱。

关键技术包括：1）Golden Gate克隆构建多拷贝基因阵列；2）双相机同步成像系统捕捉转录位点共定位；3）基于TrackMate的单个细胞追踪分析；4）mRNP-SiMPull定量蛋白 stoichiometry（化学计量）；5）3′-TagSeq转录组分析验证系统特异性。

基因阵列系统的构建与验证

通过迭代整合策略构建的pCUP1-GFA1₂₅和Z₃EVpr-GFA1₂₅阵列，经FISH证实可产生同步化转录爆发（

）。RNA-seq显示除GFA1和筛选标记LEU2外，仅75个基因表达受影响，证明系统特异性。

mRNP因子的动态招募图谱

时间分辨成像揭示：

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  转录因子Cup2最早到达（中位时间40秒）

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  CBC（核帽结合复合体）亚基Cbp80与Cbp20呈现阶梯式招募（40秒 vs 60秒），提示Cbp80可独立于Cbp20定位

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  TREX组分呈现功能分化：Yra1与Cbp80同步到达（40秒），而THO亚基Mft1（60秒）和Sub2（60秒）明显滞后（

  
  ）
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  未知功能蛋白Yhs7展现出与Yra1完全一致的招募动力学（40秒）

THO复合体的非经典功能

mft1Δ突变体分析颠覆传统认知：

1. 1.

   Yra1的转录位点招募和mRNP结合频率不受THO缺失影响

2. 2.

   Sub2在mRNP中的结合率下降70%（

   
   ）
3. 3.

   THO主要促进Yra1/Sub2的多拷贝装载，而非基础招募

Yra1招募的分子决定因素

结构域解析发现：

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  RRM（RNA识别基序）缺失使Yra1延迟40秒

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  酵母双杂交证实Yra1 RRM与Cbp80直接互作（）

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  甲基化酶Hmt1和泛素连接酶Tom1对招募无显著影响

研究最终提出"先驱因子网络"模型（）：Cbp80-Yra1-Yhs7通过蛋白互作形成早期装配平台，其带正电荷的内在无序区（IDR）促进新生RNA折叠，而THO则通过稳定Sub2构象调控后期成熟。该研究不仅修正了TREX复合体的功能范式，更建立了首个mRNP组装的定量时间框架，为理解RNA代谢疾病提供了分子标尺。技术方法的创新性突破使得在单细胞水平解析秒级动态过程成为可能，为后续研究不同基因特征（如内含子、应激响应元件）对组装通路的影响奠定基础。