基于PfAgo-DNAzyme级联放大技术的鼠伤寒沙门氏菌高灵敏度检测新方法

本文推荐：研究者创新性地将嗜热古菌Argonaute核酸酶(PfAgo)与无标记DNAzyme技术结合，开发了免DNA预扩增的鼠伤寒沙门氏菌(S. typhimurium)检测体系。通过系统优化5'-磷酸化/羟基化单链DNA(5'P/OH ssDNA)引导的PfAgo切割活性，建立两种检测策略：策略1利用63 nt 5'P DNAzyme作引导DNA(gDNA)，检测限(LOD)达4.5×101 CFU/mL；策略2采用64 nt 5'OH DNAzyme经RNase H2(STH2)切割产生50 nt 5'P ssDNA触发信号，LOD降至2.0×101 CFU/mL，较传统方法灵敏度提升71-160倍。

　　

亮点

本研究开发了一种基于嗜热古菌Argonaute(PfAgo)与DNAzyme级联反应的新型生物传感器，实现了鼠伤寒沙门氏菌的高灵敏度检测，无需DNA预扩增步骤。通过巧妙设计两种检测策略，将检测灵敏度显著提升71-160倍，为食源性疾病监测提供了革命性技术方案。

材料与试剂

重组质粒pET28a-RNase H2和所有寡核苷酸序列由生工生物工程(上海)有限公司合成。实验使用的核酸序列和荧光探针详见表S1(支持信息)。本研究中使用的重组质粒pET28a-PfAgo及菌株(包括大肠杆菌BL21/DH5α、鼠伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌)均由本实验室保存和管理。

验证STH2-DNAzyme系统及PfAgo活性

前期研究表明，PfAgo是一种在80-99.9°C温度范围内具有单链DNA切割活性的新型核酸内切酶。它利用短链5'-磷酸化ssDNA(5'P ssDNA，通常15-31 nt长度)作为引导DNA(gDNA)来识别互补的目标或探针ssDNA，随后在目标序列第10与11位核苷酸之间(从gDNA的5'端开始计数)切割磷酸二酯键。PfAgo的核酸酶切割机制具有高度特异性，这为构建高灵敏度生物传感器奠定了基础。

结论

基于PfAgo-DNAzyme级联反应的生物传感器成功实现了鼠伤寒沙门氏菌的高灵敏度检测。该技术将PfAgo系统的信号放大特性与DNAzyme的特异性识别完美结合，两种策略分别获得4.5×10¹和2.0×10¹ CFU/mL的检测限(3σ)，具有良好的线性范围和检测准确性，且无需DNA提取、预扩增或预培养步骤。策略2特别克服了传统方法中信号与目标物浓度呈反比的缺陷，为现场快速检测(POCT)提供了更优解决方案。