泛素特异性蛋白酶15直接相互作用HSV-1碱性核酸酶并促进病毒重组与复制叉稳定性的机制研究

这篇突破性研究揭示了宿主去泛素化酶USP15与HSV-1重组酶UL12的直接互作机制，通过创新性运用iPOND技术证实UL12介导USP15向病毒DNA复制叉的招募。研究发现USP15缺失导致病毒复制效率降低10倍、DNA复制叉速率下降42%（1.80→1.04 kb/min），并通过SSA报告系统证明二者协同促进同源重组。该发现为HSV-1感染治疗提供了新的潜在靶点。

　　

The HSV-1 alkaline nuclease, UL12, directly interacts with the cellular ubiquitin-specific protease 15

研究团队通过Flag-UL12免疫共沉淀结合质谱分析，意外发现USP15与已知的MRN复合体共同富集。体外实验证实GST-USP15能特异性下拉纯化的Flag-UL12，互作不依赖其他蛋白因子。免疫印迹显示USP15仅与UL12共沉淀，而与对照蛋白GFP/UL8无相互作用，证实了相互作用的特异性。有趣的是，UL12核酸酶活性缺失突变体D340E仍保留USP15结合能力。

UL12 recruits USP15 to sites of viral DNA replication

运用前沿的iPOND技术揭示：在野生型KOS感染中，EdC标记的新生DNA上可检测到USP15和ICP8共富集，而UL12缺陷病毒AN-1则完全丧失USP15招募能力。邻近连接实验(PLA)显示ICP8-USP15相互作用仅在KOS感染时出现，空间距离<40nm。共聚焦显微镜定量分析显示，KOS感染的细胞核内USP15-ICP8共定位系数达0.72，而AN-1感染仅0.28。通过shRNA敲低实验排除了抗体交叉反应可能，证实观察到的核定位信号确实来自USP15。

USP15 is required for efficient HSV-1 DNA replication

基因敲除实验显示：USP15缺失使病毒产量降低10倍，空斑形成概率下降5-10倍。单分子DNA梳理技术揭示：shUSP15细胞的IdU标记DNA纤维平均长度显著缩短，复制叉速率从1.80 kb/min降至1.04 kb/min。Slot blot分析证实总IdU掺入量减少，提示全局性DNA合成障碍。值得注意的是，病毒早期基因ICP4/ICP8表达未受影响，表明缺陷发生在DNA复制阶段而非基因表达调控。

USP15 is phosphorylated during HSV-1 infection

Phos-Tag凝胶电泳发现：感染后2小时即出现USP15磷酸化迁移条带，λ磷酸酶处理可逆转该现象。令人意外的是，ATM抑制剂KU-55933和复制抑制剂BAY 57-1293均不能阻断磷酸化，提示存在ATM非依赖的修饰机制。AN-1感染时USP15磷酸化消失，而通过慢病毒回补UL12可完全恢复磷酸化，证实UL12在该过程中的核心作用。对比发现，MRN复合体成员Nbs1的磷酸化仍依赖ATM和DNA复制。

USP15 is required for maximal HSV-1 viral recombination

基于CRISPR构建的ΔUSP15 HCT-116细胞中，UL12刺激单链退火(SSA)的效率从8-9倍降至3-4倍。值得注意的是，催化失活突变体USP15 C296A虽能稳定UL12蛋白水平，却无法完全恢复SSA活性。标记拯救实验显示：USP15敲低使野生型病毒重组频率降低10倍。免疫印迹时间进程分析发现，UL12蛋白稳定性在USP15缺失细胞中显著降低，这可能是重组缺陷的重要原因。

这项研究首次绘制了HSV-1重组机器与宿主去泛素化系统的分子互作图谱，阐明了USP15通过双重机制（稳定UL12蛋白和催化依赖的DNA修复）促进病毒复制的分子范式。发现USP15的独特磷酸化特征暗示病毒可能劫持了非经典的激酶通路，为开发靶向病毒-宿主互作界面的抗疱疹药物提供了新思路。