异丙基对羟基苯甲酸酯靶向III型分泌系统抑制鼠伤寒沙门氏菌感染的机制研究

本研究首次揭示食品防腐剂异丙基对羟基苯甲酸酯（IPPB）通过结合调控蛋白HilD，特异性抑制鼠伤寒沙门氏菌（ST）III型分泌系统1（T3SS-1）关键效应蛋白（SipA/SipB等）的表达，显著降低细菌侵袭宿主细胞能力，并在感染模型中展现治疗潜力，为抗毒力策略（anti-virulence）开发提供新思路。

　　

ABSTRACT

鼠伤寒沙门氏菌（ST）作为食源性病原体，其抗生素耐药性问题日益严峻。研究团队通过550种天然化合物筛选，发现异丙基对羟基苯甲酸酯（IPPB）在不影响细菌生长的前提下，显著抑制ST对宿主细胞的侵袭。机制研究表明，IPPB通过结合关键调控蛋白HilD，抑制T3SS-1调控基因（hilD/hilC/rtsA）转录，进而阻断效应蛋白分泌。动物实验证实IPPB可改善感染模型存活率并缓解肠道菌群紊乱。

IPPB抑制ST侵袭宿主细胞

通过庆大霉素保护实验和免疫荧光染色，发现IPPB及其结构类似物MPB、IBPB能以剂量依赖性方式（4-64 μg/mL）抑制ST对HeLa和Raw264.7细胞的侵袭，但对细菌生长曲线和最小抑菌浓度（MIC=512 μg/mL）无显著影响。值得注意的是，T3SS-1缺陷株ΔinvA的侵袭能力显著降低，提示IPPB作用靶点与T3SS-1相关。

T3SS-1效应蛋白分泌抑制

考马斯亮蓝染色和Western blot结果显示，IPPB处理可显著减少培养上清中SipA、SipB、SipC和SopB等效应蛋白的分泌量，而对鞭毛蛋白FliC无影响。β-内酰胺酶报告系统进一步证实，IPPB能剂量依赖性抑制SipA-TEM向宿主细胞的转运效率，64 μg/mL处理组效应蛋白分泌量降低约5倍。

转录调控网络干扰机制

qPCR分析揭示IPPB通过抑制hilD/hilC/rtsA等调控基因表达（最高下调4.1倍），进而降低T3SS-1结构基因（prgH/prgK/invG）和效应基因（sipA/sipB/sipC）的转录水平。过表达实验显示，pJL03-hilD质粒可部分逆转IPPB对SipA的抑制作用。荧光淬灭实验测得IPPB与HilD的结合常数K_a=6.157×10^?4 L/mol，DARTS实验证实IPPB能保护HilD免受蛋白酶降解。

体内外感染模型验证

在蜡螟幼虫模型中，IPPB（250 μg/kg）处理使感染ST的幼虫72小时存活率提升至40%，病理切片显示其显著缓解肠道绒毛脱落和皮下水肿。小鼠实验表明，IPPB（25 mg/kg）治疗可使ST感染死亡率降低30%，肝脏/脾脏细菌载量减少，并改善肠道菌群结构——显著降低Erysipelatoclostridium丰度，同时提升Ligilactobacillus和Candidatus_saccharimonas等有益菌比例。

讨论与展望

该研究首次阐明食品添加剂IPPB通过靶向HilD-T3SS-1通路发挥抗沙门氏菌感染作用，其独特的不影响细菌生长的特性可减少耐药性产生。相较于已报道的T3SS抑制剂（如cytosporone B、肉桂醛），IPPB具有明确的靶点结合机制和良好的体内疗效，为开发新型抗毒力药物提供了候选分子。未来研究需进一步优化IPPB的给药方案，并探索其与其他抗菌剂的协同作用。