橡胶树乳清提取物中杀菌剂的鉴定及其对兰花黑腐病病原菌棕榈疫霉的抑制作用研究

这篇研究首次从橡胶树（Hevea brasiliensis）乳清废弃物中鉴定出两种关键抗真菌化合物——1,2-二硫杂环己烷-4,5-二醇（DTD）和2,4-二叔丁基苯酚（2,4-DTBP），并通过体外和温室实验证实其对兰花黑腐病病原菌棕榈疫霉（Phytophthora palmivora）具有协同抑制作用。研究揭示了乳清粗提物中防御蛋白（如几丁质酶、hevamine等）与活性化合物的协同作用机制，为开发天然植物源杀菌剂提供了创新思路。

　　

1 引言

天然橡胶乳胶作为从橡胶树（Hevea brasiliensis）中获取的原料，其非橡胶组分（乳清）常被视为工业废弃物。泰国作为全球最大橡胶出口国，每年产生大量乳清副产物。研究发现乳清中含有抗真菌成分，而棕榈疫霉（Phytophthora palmivora）是导致兰花黑腐病的主要病原体，传统化学杀菌剂如甲霜灵（metalaxyl）存在环境隐患。本研究聚焦橡胶乳清的资源化利用，探索其对棕榈疫霉的抑制机制。

2 材料与方法

2.1 实验材料

从泰国东部（罗勇府）和南部（董里府、素叻他尼府）采集RRIT251和RRIM600克隆橡胶树的新鲜乳胶，经离心获得乳清。病原菌采用泰国生物资源研究中心提供的棕榈疫霉（TBRC 14678），通过组织移植法从感染黑腐病的莫氏兰中分离纯化。

2.2 粗提物制备

乳清经20,000 rpm超速离心后，依次通过30 kDa和3 kDa超滤膜，冻干获得粗提物。RRIT251和RRIM600的粗提物得率分别为30%和33%。

2.3 GC-MS分析

采用固相微萃取-气相色谱质谱联用技术（SPME-GC-MS）鉴定活性成分。RRIT251乳清中检测到16种峰，其中DTD（C₄H₈O₂S₂）和2,4-DTBP（C₁₄H₂₂O）占比分别达78.37%和100%；RRIM600中DTD占39.40%。定量分析显示DTD在两种克隆中的含量分别为13.61±2.45 mg/g和12.01±2.67 mg/g。

3 结果与讨论

3.1 体外抑菌活性

采用食物毒化法评估粗提物抑菌效果。20,000 mg/L浓度下，RRIT251和RRIM600粗提物对棕榈疫霉的抑制率均达100%，显著优于单一化合物（DTD 2000 mg/L抑制率84.5%）。显微镜观察显示处理组菌丝出现皱缩、褐变等形态异常。

3.2 活性化合物协同效应

Bliss独立性模型分析表明，DTD与2,4-DTBP联合使用时（2000 mg/L + 1.25 mg/L）抑制率达96.36%，呈现从相加到协同的剂量依赖性。值得注意的是，含等量活性成分的粗提物效果优于纯化合物组合，提示乳清中防御蛋白的增效作用。

3.3 温室防效验证

在莫氏兰幼苗实验中，40,000 mg/L粗提物处理组对黑腐病的预防效果达85.1%（RRIT251）和79.33%（RRIM600）。病原菌接种后处理组病斑直径较对照组减少82.56%，与2000 mg/L甲霜灵效果相当。

3.4 蛋白质组学分析

通过SDS-PAGE和2-DE技术鉴定出14种防御相关蛋白，包括几丁质酶（PR-3家族）、hevamine（Hev b 14）、prohevein（Hev b 6.01）等。这些蛋白通过水解真菌细胞壁几丁质和β-1,3-葡聚糖发挥抑菌作用。其中几丁质结合域（CBD）被证实是抗真菌活性的关键结构。

4 结论

研究首次揭示橡胶乳清废弃物中DTD和2,4-DTBP的协同抗真菌机制，结合其丰富的防御蛋白（如几丁质酶、hevamine等），为开发新型生物农药提供了理论基础。该成果不仅拓展了农业废弃物的高值化利用途径，也为兰花等经济作物的绿色病害防控提供了可行方案。未来需进一步优化制剂工艺并评估长期生态安全性。