CYP82G1酶作为色原酮羟化酶在沉香6-羟基-2-(2-苯乙基)色原酮生物合成中的关键作用

本研究揭示了Aquilaria sinensis（白木香）中CYP82G1酶催化2-(2-苯乙基)色原酮（PEC）C-6位羟基化的分子机制。通过转录组学和LC-MS/MS分析，鉴定出52个候选CYP基因，证实AsCYP82G1能将PEC转化为6-羟基-PEC（6-HPEC），其活性中心关键残基为MET-222/ARG-223。该发现为沉香树脂合成途径解析、优质品种选育及合成生物学生产PECs提供了理论依据。

　　

1 引言

Aquilaria sinensis（白木香）作为瑞香科植物，在创伤或感染后会形成富含2-(2-苯乙基)色原酮（PECs）的沉香树脂。PECs是沉香香气和药理活性的核心成分，其中C-6位羟基化是结构多样化的关键步骤。尽管前期研究已发现参与PEC骨架合成的III型聚酮合酶（PKSs），但负责羟基化修饰的细胞色素P450（CYPs）仍属未知。本研究通过比较野生型与奇楠型白木香在钻孔处理后的基因表达差异和PECs积累模式，旨在揭示PECs羟基化的分子机制。

2 结果

2.1 钻孔处理对PECs积累的影响

LC-MS/MS分析显示，野生型白木香中agarotetrol等羟基化PECs含量显著高于奇楠型，其中6-HPEC含量最高可达552.77倍差异。钻孔处理6小时后，野生型中5种PECs含量呈现爆发式增长，表明机械损伤有效诱导了PECs生物合成。

2.2 转录组分析揭示CYP候选基因

通过WGCNA共表达网络分析，从26,441个unigenes中筛选出与PECs正相关的4个模块（洋红色/黑色/棕褐色/青绿色），包含52个CYP候选基因。其中Unigene0047038（命名为AsCYP82G1）在野生型中的表达量显著高于奇楠型，qPCR验证其表达模式与RNA-seq数据一致。

2.3 AsCYP82G1的酶活验证

在酵母WAT11表达系统中，AsCYP82G1微体制剂能将PEC转化为6-HPEC（保留时间20.35分钟），质谱碎片模式与标准品完全匹配。大肠杆菌共表达系统（pCDFDuet-1-ATR1-AsCYP82G1）同样证实该催化活性，产物峰面积较对照提升8.41倍。

2.4 体内功能验证

本氏烟瞬时表达实验显示，AsCYP82G1转化叶片中6-HPEC含量提升7.12倍。白木香茎段瞬时过表达实验进一步证实，转基因组织中6-HPEC积累量是对照组的2.57倍，且基因表达水平与产物含量呈正相关。

2.5 催化机制解析

同源建模显示AsCYP82G1与A0A061FJG8.1.A模板具有71.48%相似性。分子对接发现其活性口袋由MET-222/ARG-223等9个残基构成，其中MET-222通过硫-π相互作用稳定底物。量子力学计算揭示：当底物位于酶右侧时，C6-C7环氧化能垒为16.2 kcal/mol，后续水解反应能垒仅9.5 kcal/mol，证实该催化路径的热力学可行性。

3 讨论

本研究首次鉴定出参与PECs羟基化的CYP82G1酶，拓展了CYP82家族在非萜类代谢中的功能认知。该发现为沉香质量评价提供了分子标记，通过调控AsCYP82G1表达可定向合成高价值6-HPEC衍生物。未来需解析C-5/7/8位羟基化酶，以完整重构PECs修饰网络。

4 实验方法

采用Illumina NovaSeq 6000平台完成42个样本转录组测序（264.41 Gb数据量），使用Trinity软件组装134,527个unigenes。酶活分析采用酵母微粒体/大肠杆菌双表达系统，产物经UPLC-MS/MS（Agilent 6420 Triple Quad）检测。QM计算采用Gaussian 16软件的B3LYP/def2-SVP方法，溶剂模型选用SMD连续介质模型。