PCR生成DNA模板：高效快速且经济实惠的mRNA合成新策略

【编辑推荐】本研究突破性地采用PCR扩增技术制备线性DNA模板，替代传统质粒线性化方法，显著提升体外转录(IVT)效率。实验证明该方法在mRNA产量、质量及新冠mRNA-LNP疫苗免疫原性方面均媲美传统方法，为疫苗和 therapeutics开发提供更快速、经济的解决方案。

亮点

本研究建立并优化了基于PCR扩增的线性DNA模板制备方法，用于体外转录(IVT)和mRNA合成。通过系统比较发现，与传统质粒线性化方法相比，这种无细菌参与的PCR技术能更快获得更高产量的DNA模板和mRNA转录本，且完全保持mRNA产品的质量和完整性——经凝胶电泳和蛋白表达分析双重验证。

讨论

我们开发的新型PCR扩增法为IVT提供线性DNA模板。经过详细优化和系统对比实验证实，该方法在速度、产量方面显著优于传统质粒法，且不影响最终mRNA产品的品质。相较于需要细菌培养、质粒提取和酶切线性化的传统方法（耗时数天），PCR法可在数小时内完成，尤其适合需要并行合成多种mRNA构建体的高通量筛选场景。

DNA质粒构建与线性DNA模板制备

GFP和SARS-CoV-2刺突蛋白的密码子优化基因序列经合成后克隆至IVT专用载体。线性DNA模板通过两种方法制备：

1）质粒DNA酶切线性化：细菌培养扩增后，用高保真限制性内切酶Hind^III消化；

2）PCR扩增法：使用M13通用引物从质粒模板直接扩增目标序列。

竞争利益声明

作者声明不存在可能影响本研究的财务或个人利益冲突。

致谢

本研究部分受NIH基金AI181134支持。H.H.作为主要研究者获NIH基金AI157852和AI181134资助。N.C.H.受NIH T32培训基金AI060549支持。