嗜热细菌Acetivibrio thermocellus来源的GH43_26家族外切型α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶AtAbf43C的结构与功能解析

本研究针对木质纤维素降解过程中阿拉伯糖基多糖的酶解机制问题，对嗜热细菌Acetivibrio thermocellus的GH43_26家族酶AtAbf43C进行结构功能解析。通过晶体结构解析（分辨率1.32-2.32 ?）和酶学表征，发现该酶在pH 5.5和65°C下对α-1,5连接的阿拉伯寡糖(AOS)具有外切活性，其独特的CBM42-GH43结构域反向排列为首次报道。研究成果为开发高效生物质转化工具酶提供新思路。

　　

在自然界中，植物细胞壁的主要成分木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，但其复杂的结构使得高效降解成为重大挑战。其中，含有阿拉伯糖残基的半纤维素（如阿拉伯木聚糖和阿拉伯聚糖）的分解需要特异性糖苷水解酶的参与。尽管已有多种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（EC 3.2.1.55）被鉴定，但嗜热菌来源的GH43_26家族酶的结构与功能特性仍存在认知空白。这项发表在《Biochemical Journal》的研究，聚焦于嗜热厌氧菌Acetivibrio thermocellus DSM1313中未表征的GH43_26家族酶AtAbf43C，揭示了其在高温环境下的独特催化机制。

研究人员通过基因克隆获得去除信号肽和dockerin结构域的AtAbf43C重组蛋白（残基21-511），利用X射线晶体学解析了全长蛋白（PDB 9NXG）、阿拉伯糖结合状态（PDB 9NXH）以及单独CBM42（PDB 9NXI）和GH43（PDB 9NXJ）结构域的高分辨率结构。结合定点突变、酶动力学分析和LC-MS水解产物检测，系统阐明了该酶的催化特性。样本来源于德国微生物保藏中心的A. thermocellus DSM1313菌株。

序列分析与GH43_26酶多样性

通过系统发育分析发现，AtAbf43C与已报道的10种细菌GH43_26酶具有49-63%的序列相似性。该蛋白包含N端CBM42结构域（残基29-160）和C端GH43催化结构域（残基179-488），与同家族模式酶SaAraf43A（链霉菌来源）呈现独特的结构域反向排列特征。

AtAbf43C酶学活性

酶学表征显示该酶在pH 5.5和65°C时对合成底物对硝基苯酚-α-L-阿拉伯呋喃糖苷（pNPAra）活性最高，Ca²⁺可显著增强其活性。动力学参数显示其K_m高达22.7 mM，接近pNPAra的水溶性极限，k_cat/K_m值为11.9 s^-1mM^-1。

晶体结构与突变研究

1.32 ?分辨率的全长结构揭示：GH43结构域形成典型的五叶β-螺旋桨，催化三联体为D168/D283/E344；CBM42结构域呈β-三叶草折叠，阿拉伯糖结合于β和γ亚域（非α亚域）。定点突变证实催化三联体的必需性，而推测的Mg²⁺结合位点H408突变后活性反而提升。

天然底物水解特性

LC-MS分析表明，AtAbf43C特异性水解α-1,5连接的阿拉伯寡糖（A2-A5）和阿拉伯聚糖，释放游离阿拉伯糖，但对阿拉伯木聚糖寡糖（A²XXX/XA³XXX）无活性，证实其外切酶特性。

这项研究首次报道了嗜热菌GH43_26家族酶的反向结构域排列模式，其高温适应性（65°C最适温度）拓展了工业酶应用的温度范围。结构解析揭示了CBM42结构域中功能性糖结合口袋的分布规律，为设计高效多糖降解酶提供了模板。特别值得注意的是，与同家族酶SaAraf43A相比，尽管催化核心保守，但AtAbf43C对阿拉伯木聚糖的低活性暗示了GH43_26亚家族可能存在更精细的底物特异性分化。这些发现不仅完善了CAZy数据库的注释信息，也为开发木质纤维素生物精炼的新型酶制剂奠定了理论基础。