双探针连接原位杂交结合滚环扩增技术实现高复杂度空间转录组分析

为解决FFPE样本中mRNA降解严重、空间转录组技术复杂度不足的问题，研究人员开发了LISH-LnR技术，通过双探针连接和滚环扩增(RCA)实现在原位上对数百种mRNA及其剪接变体的精确定位。该技术结合分子"变阻器"调控信号强度，在肌肉炎和横纹肌肉瘤样本中成功解析了XBP1剪接变体的空间分布特征，为临床病理研究提供了强大工具包。

　　

在生物医学研究领域，组织结构的空间信息正变得越来越重要。特别是临床最常见的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本，虽然能长期保存组织结构，但其中的mRNA往往存在严重降解问题。目前的空间转录组技术面临两大挑战：一是难以在高度降解的FFPE样本中获得可靠信号，二是缺乏对关键mRNA剪接变体的空间定位能力。Sarah E. Maguire团队发表在《Biochemistry and Biophysics Reports》的研究，正是为了解决这些关键技术瓶颈。

研究人员开发了名为LISH-Lock'n'Roll(LISH-LnR)的创新技术平台，该技术整合了双探针连接、滚环扩增(RCA)和组合荧光探针检测三大核心方法。研究使用A549细胞系验证基础性能，并分析了来自包涵体肌炎(IBM)患者和儿童横纹肌肉瘤(RMS)患者的临床样本。特别值得注意的是，研究团队还建立了LISH-QC质量控制系统和LISH-seq测序验证方法，形成了一套完整的空间转录组研究工具包。

研究结果部分，首先在"原位创建和检测LISH-LnR产物"中，团队设计了包含4个读出探针结合位点的双探针系统，在固定细胞中实现了45.4个GAPDH和43.1个ACTIN特异性信号/细胞，且几乎无错配。在"高通量LISH-LnR检测的自动化和调控"部分，研究人员开发了24位编码方案可同时检测378个靶标，并创新性地提出两种"分子变阻器"策略：通过非连接性"诱饵"探针选择性降低高丰度靶标(如18S rRNA)的信号，以及通过ddNTP调控滚环产物(RCP)大小。

在"高通量LISH-LnR面板的成像和解码"部分，372个探针组成的免疫肿瘤学面板在Veranome空间分析仪上实现了自动化检测。在IBM肌肉活检样本中，发现IgG mRNA的高表达提示浆细胞浸润，且空间异质性明显。LISH-LnR结果与LISH-seq(r=0.917)和RNA-seq(r=0.987)高度一致。

"LISH-QC用于空间转录组前的样本快速质控"部分展示了该技术如何解决FFPE样本mRNA完整性评估难题。通过模拟RNase A降解实验证明，LISH-QC可线性反映样本质量，与下游分析性能高度相关(r>0.8)。

最具创新性的"LISH-LnR定位mRNA剪接变体"研究中，团队设计了特异性探针区分XBP1剪接变体。在thapsigargin处理的A549细胞中，XBP1-s/XBP1-u比例显著增加。在RMS患者FFPE样本中，发现未剪接XBP1-u在三级淋巴结构(TLS)中富集，提示这些区域可能存在内质网应激预备状态。

在讨论部分，作者强调LISH技术平台的三位一体优势：LISH-LnR提供空间信息，LISH-QC实现样本质控，LISH-seq辅助探针设计。特别是针对26nt的XBP1剪接事件检测能力，突破了现有技术对短序列变体的分析局限。研究还展示了通过"分子变阻器"精细调控信号强度的灵活性，为不同应用场景提供优化空间。

这项研究的技术意义在于：首先，克服了FFPE样本mRNA降解的技术难题；其次，通过组合编码实现高复杂度检测；最重要的是，首次实现了对重要剪接变体的空间定位。在临床应用方面，该技术为肿瘤微环境研究、自身免疫疾病机制解析提供了新工具。特别是对XBP1剪接变体在RMS中空间分布规律的发现，为理解肿瘤免疫互作提供了新视角。随着进一步优化，这套技术平台有望成为临床病理诊断的有力武器。