肽类凝聚体保护寡核苷酸免遭核酸酶降解并可控释放用于转录翻译的研究

为解决核酸药物递送过程中易被核酸酶降解的难题，研究人员开展了基于肽类凝聚体(coacervate)的核酸保护与控释研究。通过构建聚组氨酸肽(polyhistidine)-ATP复合凝聚体和HGLGY简单凝聚体，证实前者能高效保护短链DNA和荧光素酶基因免受多种核酸酶降解，并可通过离子强度或温度变化触发释放。该研究为开发新型生物相容性递送载体和无细胞合成生物学平台提供了重要理论依据。

　　

在生命科学领域，如何安全有效地递送功能性核酸分子一直是重大挑战。游离的寡核苷酸(oligonucleotides)在细胞内外都极易被核酸酶(nuclease)降解，这严重制约了基因治疗和合成生物学的发展。虽然科学家们发现自然界存在的无膜细胞器(membraneless organelles)——即通过液-液相分离(liquid–liquid phase separation)形成的生物分子凝聚体(biomolecular condensates)——能够调控细胞内核酸代谢，但人工设计的凝聚体能否作为核酸递送载体仍存在诸多未解之谜。

针对这一科学问题，美国海军研究实验室的Angelica Rose Galvan等研究团队在《Biomacromolecules》发表重要成果。研究人员创新性地采用两种肽类凝聚体系统：基于静电作用的聚组氨酸肽(H₉/H₁₂)-ATP复合凝聚体(associative coacervates)和基于"粘附-间隔"模型的HGLGY简单凝聚体(simple coacervates)，通过荧光共振能量转移(FRET)报告系统和无细胞转录翻译(TXTL)体系，系统评估了它们对核酸的保护与释放性能。

关键技术方法包括：(1)构建含FRET对的DNA报告系统(EcoCy3/EcoCy5)；(2)采用离心实验定量分析核酸在凝聚体中的富集效率；(3)利用荧光光谱和共聚焦显微镜监测核酸酶降解动力学；(4)通过离子强度和温度变化触发核酸释放；(5)采用商业化PURExpress TXTL系统评估荧光素酶(Luc9)基因的保护与表达效率。

【Nuclease Protection】研究发现，聚组氨酸肽-ATP复合凝聚体对短链DNA(16-30 nt)的保护效率高达97±3%，能有效抵抗Exo I/III/V、DNase I和EcoRI等多种核酸酶的降解。相比之下，HGLGY简单凝聚体仅能保护21±4%的DNA，且对1651 nt的Luc9基因几乎无保护作用。通过荧光显微镜证实，这种保护差异源于两者不同的相分离机制。

【DNA Release from Coacervates】复合凝聚体表现出优异的刺激响应特性：增加Na⁺(540 mM)或Mg²⁺(20 mM)离子强度，或升温至37-42°C均可触发DNA释放。其中Mg²⁺的释放效果最显著，能使80%以上的DNA被核酸酶降解。而HGLGY凝聚体在相同条件下难以实现可控释放。

【Protection and Release of a Gene Sequence】在含DNase I(20 u/mL)的TXTL系统中，复合凝聚体保护的Luc9基因仍能表达33%的荧光活性，而裸露DNA几乎完全失活。升温实验意外发现，聚组氨酸肽在85°C时会切割DNA骨架，这与其金属离子螯合特性相关。

研究结论深刻揭示了不同凝聚体系对核酸保护的机制差异：复合凝聚体通过聚组氨酸与核酸的强静电作用，阻碍核酸酶识别位点的接触；而简单凝聚体主要依赖疏水和π-π相互作用，保护能力有限。该研究不仅为理解生物分子凝聚体的功能调控提供了新视角，更重要的是开发出了一种可编程的核酸递送平台——通过理性设计肽序列，可精确调控核酸的保护强度与释放动力学。

这项工作的创新价值体现在：(1)首次系统比较了复合与简单凝聚体的核酸保护效能；(2)建立了基于TXTL的高通量筛选平台，极大减少了体内实验的物料消耗；(3)发现的聚组氨酸核酸酶活性为开发新型核酸工具酶提供了线索。这些发现将推动凝聚体在CRISPR基因编辑、RNA疫苗递送等领域的应用，也为研究原始生命系统的核酸保护机制提供了模型体系。