基于P67标签的β-桶状结构融合技术显著提升大肠杆菌包涵体蛋白复性效率与生物活性回收

针对大肠杆菌表达系统中重组蛋白包涵体(IB)复性效率低下的难题，本研究创新性地利用五种生物素依赖性羧化酶保守结构域P67标签(67个氨基酸)，通过其八链反平行β-折叠形成的扁平桶状结构，显著提升难复性包涵体(RHIB)蛋白如Intelectin-2和Galectin-12的复性效率(回收率达67-71%)。该标签不依赖生物素化修饰，可通过链霉亲和素系统实现可溶/不可溶蛋白的高效纯化，为重组蛋白生产提供新策略。

　　

在重组蛋白生产领域，大肠杆菌表达系统因其成本低、产量高的优势被广泛应用，但目标蛋白常以无活性的包涵体(IB)形式存在。传统复性方法面临两大瓶颈：一是化学添加剂和物理环境调控对难复性包涵体(RHIB)效果有限，二是常用融合标签如SUMO、Trx等分子量过大可能干扰蛋白功能。更棘手的是，现有His标签纯化系统在变性条件下特异性不足，而生物素-链霉亲和素系统虽稳定却缺乏高效复性标签。

这项发表于《International Journal of Biological Macromolecules》的研究创新性地从五种真核生物素依赖性羧化酶中发掘出保守结构域P67标签。该标签仅含67个氨基酸，却能形成八链反平行β-折叠的稳定空间构象。研究人员通过构建pET41a-P67-MCS表达载体，选取Collectin-10、Intelectin-2等6种IB蛋白进行系统评估，结合透析复性、HRV 3C蛋白酶切割、镍柱/链霉亲和素柱纯化等技术，首次证实P67标签可显著提升RHIB蛋白复性效率。

关键技术方法包括：1) 构建含TEV/HRV 3C蛋白酶位点的P67标签表达系统；2) 梯度尿素透析优化复性工艺；3) 通过位点定向突变验证结构-功能关系；4) 采用链霉亲和素Western blot检测生物素化；5) 鸡红细胞凝集试验评估蛋白活性。

研究结果揭示：

1. 1.

   筛选验证RHIB蛋白特性

   通过比较P67标签与无标签组在透析各阶段的溶解度，明确Intelectin-2、Galectin-12和Galectin-8S为典型RHIB蛋白，其无标签组在PBS透析后回收率不足5%，而P67标签组达67-71%。

2. 2.

   突破性缩短复性时间

   直接8M尿素→PBS的6小时快速透析方案，复性效率与常规多步透析相当，使整个IB蛋白纯化流程缩短至1天内完成。

3. 3.

   生物活性成功恢复

   P67-Int-2和截短型P67-Gal-12-N-ter均显示红细胞凝集活性，证实复性蛋白功能重构。值得注意的是，全长Galectin-12因C端可能遮蔽糖结合域而失活，揭示结构优化的重要性。

4. 4.

   结构完整性决定功能

   删除β-片层关键序列(RSPMPG等)的突变体完全丧失复性促进能力，证明八链β-桶状构象是功能基础。而MKM序列中赖氨酸突变(MEM/MPM)不影响复性效率，表明生物素化修饰非必需。

5. 5.

   横向对比标签性能

   P67在复性效率上与494aa的NusA标签相当，显著优于108aa的Trx标签，而15aa的Avi标签几乎无效，证实"最小有效结构域"假说——至少需要数十个氨基酸形成三级结构才具复性引导能力。

讨论与展望：

该研究首次阐明β-桶状结构标签可通过"结构引导"机制促进伴侣蛋白复性，其独特优势体现在三方面：1) 小分子量(仅SUMO标签的69%)减少对目标蛋白干扰；2) 双功能纯化——既可通过生物素化系统在天然/变性条件下纯化，又能作为复性"分子伴侣"；3) 结构稳定性源于β-折叠的毫秒级快速折叠特性。

局限性在于当前仅验证了15-50kD的Galectin家族蛋白，对更大分子量蛋白的适用性待考。未来研究可探索P67标签与分子伴侣的协同作用，或通过理性设计进一步缩小标签尺寸。这项技术为生物制药领域难表达蛋白的生产提供了新工具，尤其对需要维持构象的糖结合蛋白类药物开发具有重要价值。