一氧化氮通过调控氧可用性促进半胱氨酸N端降解途径的蛋白质水解

这篇研究揭示了NO（一氧化氮）通过抑制细胞色素C氧化酶（COX）调控线粒体耗氧，从而增加胞内O2可用性，间接激活2-氨基乙硫醇双加氧酶（ADO）介导的N端半胱氨酸（Nt-Cys）降解通路。该机制阐明了NO与O2感知系统的交叉调控，为G蛋白信号调节因子（RGS4/5/16）和白细胞介素-32（IL-32）的氧依赖性降解提供了新解释。

　　

Significance

氧稳态的维持需要整合细胞自主反应与组织系统反馈。2-氨基乙硫醇双加氧酶（ADO）催化的N端降解途径具有高度O₂敏感性，能动态响应氧水平变化。尽管NO对该通路的调控早有报道，但其机制一直未明。本研究揭示NO通过抑制线粒体O₂消耗，显著提升胞内O₂可用性，从而影响ADO底物稳定性，为细胞和组织氧平衡提供了新见解。

Abstract

N端含半胱氨酸（Nt-Cys）的特定蛋白通过Cys/Arg分支的N端降解途径发生快速氧依赖性水解。在哺乳动物细胞中，ADO催化半胱氨酸双加氧反应，表现出极强的O₂敏感性。该通路的经典底物包括G蛋白信号调节因子RGS4/5/16和IL-32。研究证实NO通过竞争性抑制细胞色素C氧化酶，降低细胞耗氧率，从而增加Nt-Cys双加氧反应的O₂供给。这种O₂可用性变化足以动态调节ADO底物水平，可能耦合氧供应与G蛋白偶联受体信号响应。

Results

ADO-Dependent Modulation of RGS4 Stability by NO

低氧条件下（1% O₂），慢释放NO供体DETA-NONOate显著减少RKO细胞中RGS4的积累，类似效应也见于EA.hy926细胞和HepG2细胞的IL-32。ADO基因敲除后，NO对RGS4的调控作用消失，证实ADO是NO作用的关键介质。尽管NO能稳定HIF-1α，但对RGS4或IL-32无此效应，提示PHD与ADO通路存在差异调控。

Downstream N-Degron Processing Is Unaffected by NO

通过构建MetAP非依赖型UBQ-C-RGS4:HA报告蛋白，发现NO作用于甲硫氨酸切除后的步骤。将Nt-Cys突变为天冬氨酸（D-RGS4）后，蛋白稳定性不受NO或低氧影响，但能被蛋白酶体抑制剂MG132稳定，表明NO仅调控ADO活性阶段。抗氧化剂处理或长期低氧预适应均不改变NO效应，排除了NO与O₂自发氧化Nt-Cys的可能性。

Modulation of Intracellular O₂ Levels by NO

线粒体复合体I/III抑制剂罗替宁和抗霉素A比NO更显著降低RGS4积累。使用氧敏感纳米颗粒检测发现，NO和抗霉素A均延缓低氧诱导的胞内O₂下降速率。在10% O₂生理条件下，NO使胞内O₂水平提升50%，导致RGS4稳态水平显著降低。引入替代氧化酶（AOX）部分逆转了NO和抗霉素A的效应，证实线粒体呼吸抑制是NO作用的核心机制。

Discussion

Nt-Cys双加氧反应最初被认为同时依赖NO和O₂，但本研究表明ADO在无NO条件下仍能催化该反应。NO通过竞争性结合细胞色素C氧化酶，在生理氧范围内（1-5% O₂）形成双相调控：短期低氧暴露时延缓底物积累，长期则趋于平衡。这一发现解释了为何3T3-NIH成纤维细胞和心肌细胞中NO能通过旁分泌调节组织氧分布影响RGS4降解。与植物PCO-ERFVII通路不同，哺乳动物ADO系统更强调线粒体呼吸与G蛋白信号的耦合。

Limitations of the Study

未全面评估NO所有潜在作用机制（如ADO的S-亚硝基化修饰），且仅使用DETA-NONOate模拟NO释放。不同NO源可能通过其他途径影响该通路。

Materials and Methods

采用CRISPR-Cas9构建ADO敲除细胞系，通过MitoXpress INTRA纳米颗粒实时监测胞内O₂。报告基因实验使用RGS4_1-11GFP稳定转染细胞，免疫印迹分析RGS4、IL-32等蛋白水平。数据揭示NO通过"线粒体刹车"效应重塑氧微环境，为理解氧感知与气体信号分子互作提供了范式。