基于LC-MS/MS CID与EAD技术的口服GLP-1类似物MEDI7219体外代谢产物鉴定及酶切位点分析

这篇研究采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）结合碰撞诱导解离（CID）和电子激活解离（EAD）技术，系统解析了口服GLP-1类似物MEDI7219在胰酶消化下的代谢产物特征。研究发现13种代谢产物对应8个酶切位点，证实α-甲基化苯丙氨酸对胰蛋白酶/胃蛋白酶具有显著保护作用，为优化口服肽类药物的胃肠道稳定性提供了关键靶点。

　　

ABSTRACT

口服肽类药物常因消化酶快速降解导致半衰期短。通过系统肽工程和制剂优化开发的临床候选药物MEDI7219，是一种口服生物可利用的GLP-1类似物，其模拟肠液中2小时稳定性达60%。本研究采用LC-MS/MS结合CID和EAD技术，深入解析了MEDI7219的酶解产物特征。

Method

通过胰蛋白酶体外孵育实验，结合CID（碰撞能量40V）和EAD（电子动能11eV）两种碎裂模式，在SCIEX ZenoTOF 7600系统上进行分析。使用定制化软件Molecule Profiler匹配α-甲基化氨基酸（如α-methyl-L-phenylalanine）和脂质侧链（C₃₅H₆₃N₅O₁₁）等特殊结构。

Results

1. 1.

   结构表征：CID产生连续b/y离子，EAD主要生成c/z离子。脂质侧链在CID中优先断裂β位C-O键（特征峰m/z 355/500），而EAD在酰胺羰基附近断裂（特征峰m/z 417/562）。

2. 2.

   代谢产物：鉴定出13种代谢物，对应8个酶切位点。时间曲线显示M2/M13为第一代产物（0.5小时达峰），M12/M10/M8为持续积累的第二代产物。

3. 3.

   保护机制：α-甲基-L-苯丙氨酸能完全抵抗胰凝乳蛋白酶/胃蛋白酶切割，但脂质修饰的赖氨酸仍存在酶切风险。

Discussion

胰酶特异性解释大部分切割位点：

• •

  胰蛋白酶切割赖氨酸/精氨酸（8/13代谢物）

• •

  弹性蛋白酶作用于丙氨酸/缬氨酸/亮氨酸

• •

  苏氨酸/谷氨酸切割位点可能涉及未知酶活性

  值得注意的是，双脂质修饰和5处α-甲基化使MEDI7219稳定性显著优于野生型GLP-1和semaglutide。

Conclusion

该研究建立了口服肽类药物体外代谢分析的金标准：

1. 1.

   EAD与CID互补提升鉴定可靠性

2. 2.

   酶切热点图谱指导理性设计（如扩大α-甲基化保护）

3. 3.

   为后续体内代谢研究提供预测模型

Article highlights

• •

  技术创新：首次在肽代谢研究中并行应用CID/EAD，电子动能优化至11eV

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  临床意义：揭示α-甲基化对芳香族氨基酸的保护效果优于脂质修饰

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  产业价值：建立15ppm质量容差的代谢物筛选流程，适用于复杂修饰肽分析