基于反向疫苗学和免疫信息学设计的mRNA多表位狂犬病疫苗：计算生物学驱动的创新疗法

本研究针对传统狂犬病疫苗免疫应答不完全、需多次接种等局限性，通过反向疫苗学和免疫信息学方法，从狂犬病病毒(RV)核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)和糖蛋白(G)中筛选出21个高抗原性表位，构建了新型mRNA多表位疫苗。该疫苗通过分子对接和200ns分子动力学模拟证实与TLR4受体稳定结合，全球人群覆盖率达96.01%，可同时激发体液免疫和细胞免疫，为开发下一代狂犬病疫苗提供了创新方案。

　　

狂犬病仍是全球公共卫生重大威胁，每年导致约59,000人死亡，其中非洲地区负担最重。尽管现有细胞培养疫苗(CCV)有效，但仍存在免疫应答不完全、需多次接种、冷链运输要求高等局限。特别是突尼斯2021-2024年暴发导致25人死亡的事件，凸显了开发新型疫苗的紧迫性。狂犬病病毒(RV)属于弹状病毒科，其糖蛋白(G)是中和抗体的主要靶点，核蛋白(N)能激活T细胞应答，而磷蛋白(P)和基质蛋白(M)分别参与病毒复制和免疫逃逸。这些特性使其成为疫苗设计的理想靶点。

为突破传统疫苗局限，Wafa Tombari团队在《Scientific Reports》发表研究，采用计算生物学方法设计新型mRNA多表位疫苗。研究首先从NCBI获取RV五种蛋白序列，通过Clustal Omega进行多序列比对，EMBOSS生成共识序列。使用VaxiJen筛选出G、P、N、M四种抗原性蛋白(分值>0.4)作为靶点。通过NetCTL1.2预测CTL表位，NetMHCIIpan预测HTL表位，结合BCPREDS、ABCpred等五种工具预测B细胞表位。筛选标准包括抗原性、非过敏原性、非毒性及与非人类蛋白低同源性。最终选取的21个表位(4个CTL、4个HTL和13个LBL)通过分子对接验证与HLA等位基因的结合能力，并构建包含L7/L12佐剂的mRNA疫苗。采用trRosetta进行三维建模，经200ns分子动力学模拟评估TLR4-疫苗复合物稳定性，最后通过C-ImmSim进行免疫模拟预测。

蛋白筛选与表位预测

从NCBI获取的RV蛋白序列经分析显示，G、P、N、M四种蛋白抗原性显著(VaxiJen>0.44)，保守性达94.27%-100%。B细胞表位预测发现13个线性表位，如G蛋白的²⁷PDKLGPWSPIDIHHLSCPNNLVVED⁵¹(抗原性0.8849)。CTL表位筛选出4个9肽，如N蛋白²⁵LTAREAILY²⁹可结合6种HLA I类分子(IC50 16.37-470.19nM)。HTL表位鉴定出4个15肽，如G蛋白⁶³ELKVGYISAIKVNGF⁷⁷能结合7种HLA II类分子并诱导IFN-γ分泌。

疫苗设计与验证

构建的mRNA疫苗包含5'帽、Kozak序列、UTR和polyA尾，编码区采用AAY、GPGPG和KK连接表位，加入L7/L12佐剂增强免疫应答。理化分析显示分子量52.1kDa，等电点8.13，不稳定指数32.76(稳定)，溶解度0.89。三级结构预测显示53%卷曲、32%α螺旋，Ramachandran图93.2%残基位于优选区，ERRAT质量因子94.72，ProSA Z值-5.39，证实结构合理。

分子对接与动态模拟

疫苗与TLR4(PDB 3FXI)对接显示结合能-1655.0kcal/mol，形成23个氢键和2个盐桥。200ns分子动力学模拟显示复合物RMSD在150ns后稳定于3.2-3.4nm，半径回旋(Rg)从6.0nm降至4.25nm，溶剂可及表面积(SASA)稳定在620nm2，主成分分析(PCA)显示构象空间受限，证实结合稳定。

免疫模拟与表达优化

C-ImmSim预测显示疫苗能诱导高水平IgG/IgM、记忆B细胞和Th1反应(120,000细胞/mm³)，促进IFN-γ、IL-2分泌。密码子优化后CAI达0.92，GC含量58.33%，RNAFold预测mRNA二级结构稳定(ΔG=-1655.0kcal/mol)。

该研究通过系统性的计算设计，开发了全球覆盖率96.01%的狂犬病mRNA多表位疫苗，尤其对非洲高风险地区覆盖率达92.54%。疫苗能同时激活CTL、HTL和B细胞应答，且结构稳定。虽然仍需实验验证，但该方法为应对狂犬病挑战提供了新思路，特别是对冷链条件有限的地区具有重要意义。研究创新性地整合了免疫信息学、结构生物学和动态模拟技术，为其他传染病疫苗设计提供了范式。未来研究需关注该疫苗在动物模型中的保护效力及递送系统的优化。