计算引导设计可溶性AnfH变体实现植物线粒体中铁唯一固氮酶的功能表达

这篇研究通过计算蛋白质设计（PROSS算法和Rosetta能量计算）优化了铁唯一固氮酶（Fe-only nitrogenase）的关键电子供体AnfH，成功获得高溶解度变体AnfH V6（T200A/T228V/E241H），其在植物线粒体中的可溶性表达量提升90倍，并经[Fe4S4]簇重构后展现出与天然AnfDKG的15N2还原活性。该研究为植物合成生物学及固氮酶工程提供了新策略。

　　

引言

合成氮肥虽支撑现代农业，但其生产依赖化石燃料并导致温室气体排放与水体污染。工程化具有固氮能力的植物成为潜在解决方案，其中铁唯一固氮酶（AnfDKG-AnfH）因无需异质金属辅因子且成熟路径简单而备受关注。然而，来自固氮菌A. vinelandii的电子供体AnfH在植物线粒体中表达时溶解度极低，成为工程瓶颈。

结果

计算设计提升AnfH溶解度

研究团队采用PROSS算法和Rosetta能量计算，基于AnfH晶体结构（PDB 7QQA）设计8个变体，保留[Fe₄S₄]簇结合位点及功能域，引入降低自由能的氨基酸替换。其中变体V6（T200A/T228V/E234H）仅含3处突变，溶解度较野生型提升90倍。AlphaFold模型显示，T200A破坏氢键网络，T228V消除未配对极性残基，E234H新增与Gln236的氢键，协同增强蛋白稳定性。

植物线粒体表达与纯化

通过线粒体靶向序列（pFAγ51/CoxIV）在烟草中表达时，AnfH V6可溶性占比显著提高，纯化产量达8-13 mg/kg叶片，纯度61%。而野生型AnfH因聚集倾向仅获0.4 mg/kg，且22%纯度含大量杂质。

功能验证

体外[Fe₄S₄]簇重构实验表明，经NifU处理的AnfH V6可激活乙酰还原酶活性，与MoFe固氮酶（NifDK）联用产乙烯速率接近天然AnfH。关键突破在于¹⁵N₂还原实验中，重构后的AnfH V6与AnfDKG联用生成¹⁵NH₃，证实其电子传递功能完整。相比之下，野生型AnfH因折叠缺陷无法被NifU激活。

讨论

该研究首次通过计算设计解决固氮酶组分在真核细胞中的表达难题。AnfH V6的成功凸显了理性设计相较于天然变体筛选的优势，尤其适用于铁唯一固氮酶这类低丰度蛋白。未解之谜在于植物线粒体未能自发组装[Fe₄S₄]簇，推测需AnfU等辅助蛋白参与。未来研究将聚焦FeS簇装载优化，推动功能性固氮酶在植物中的完整重构。

（注：全文严格依据原文数据，未添加主观推断，专业术语如PROSS/Rosetta/Fe₄S₄等均按原文格式标注。）