囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)第四胞内环致病突变体的计算机模拟、体外及离体表征及其调节剂的拯救作用

这篇研究通过计算机模拟(in silico)、体外(in vitro)和离体(ex vivo)实验系统表征了CFTR第四胞内环(ICL4)关键突变体(L1065P/R1066C/L1077P)的结构缺陷机制，发现三重调节剂组合(ETI)可有效恢复突变体50%以上的野生型功能。研究创新性地结合分子动力学模拟与患者来源鼻上皮细胞(HNEC)模型，证实ICL4突变通过破坏盐桥(R1066C)、疏水作用(L1065P)和螺旋稳定性(L1077P)导致蛋白错误折叠，为罕见CFTR突变体的精准治疗提供了重要依据。

　　

分子机制解析

研究聚焦CFTR蛋白第四胞内环(ICL4)的关键氨基酸残基L1065、R1066和L1077。通过分子动力学模拟发现：R1066与NBD1结构域E474形成的盐桥对维持蛋白构象至关重要，而R1066C突变导致该盐桥断裂；L1065通过疏水作用与F508、W496等残基形成稳定口袋，L1065P突变破坏该结构；L1077P则因脯氨酸的刚性特征破坏α螺旋稳定性。高温(350K)加速模拟显示，这些突变显著降低蛋白结构稳定性。

体外功能验证

在CFBE41o-支气管细胞模型中，ICL4突变体仅表达未成熟糖基化形式(条带B)。经24小时三重调节剂(ELX/TEZ/IVA)处理后：

• L1065P和R1066C成熟体(条带C)表达量达F508del的80%

• HS-YFP荧光淬灭实验显示氯离子转运功能恢复至野生型的40-50%

• 表面表达检测(hIBIT)证实突变体膜定位显著改善

患者数据印证

来自16例CF患者的原代鼻上皮细胞(ALI培养16-18天)显示：

1. 1.

   L1065P/最小功能(MF)基因型：ETI处理使短路电流从0提升至11-13μA(正常值的40%)

2. 2.

   R1066C纯合子：电流恢复至15μA(正常值50%)

3. 3.

   FDA已批准的L1077P突变体：电流达20-22μA(70%正常值)

模型比较发现

与Fischer大鼠甲状腺(FRT)异源表达系统相比，患者来源细胞对ETI响应更显著：

• R1066C在FRT中响应<10%(判定阈值下)，但在HNEC中达15-40%

• 蛋白成熟度分析显示鼻细胞中糖基化效率更高

临床意义

研究证实：

1. 1.

   ICL4结构域是CFTR正确折叠的关键调控区域

2. 2.

   三重调节剂通过协同作用纠正不同结构域缺陷

3. 3.

   患者来源细胞模型比传统细胞系更能预测临床疗效

4. 4.

   25-45%的野生型功能恢复可能产生临床获益

该工作为罕见CFTR突变纳入精准治疗方案提供了实验依据，同时揭示了不同模型系统在药物评估中的互补价值。