一种19F-ATCUN肽NMR探针，用于在复杂的生物介质中选择性检测Cu2+或Ni2+

《Chemistry – A European Journal》：A 19F-ATCUN Peptide NMR Probe for Selective Cu2+ or Ni2+ Sensing in Complex Biological Media

设计并合成了基于ATCUN结构的19F-ATCUN肽探针，实现Ni2?和Cu2?的选择性检测，19F NMR技术避免生物荧光干扰，检测限分别为4 μM和10 μM，适用于铜相关疾病研究。

　　铜和镍是自然界中常见的金属元素，它们在生物系统中扮演着重要的角色。铜在人体中是必需的，而镍虽然对人体非必需，但在某些植物和微生物中却不可或缺。然而，当这些金属元素的浓度超过一定阈值时，它们会变得有毒，因此，准确检测和量化这些金属在不同生物或环境系统中的存在变得尤为重要。这种检测不仅可以帮助我们更好地理解这些金属离子的稳态和毒性机制，还为相关疾病的诊断和治疗监测提供了重要的工具。

在生物系统中，铜通常以Cu?和Cu2?两种形式存在。其中，Cu2?是主要的氧化状态，尤其在富含氧气和氧化环境的细胞外液中，如血液清蛋白、尿液、胆汁或脑脊液中。铜的总浓度和不同形态取决于具体的生物环境，但通常情况下，Cu?或Cu2?主要与配体结合。在评估铜的生物可利用性时，必须考虑热力学和动力学因素。尽管铜通常与酶类形成强而稳定的结合，但在某些情况下，铜可以以更易交换的形式存在于生物分子中，例如与血清白蛋白（HSA）结合，其结合常数（log Kd，在pH 7.4条件下）约为13。此外，铜也可能与小分子配体如氨基酸、有机酸或阴离子结合，这进一步表明了铜在生物系统中的复杂存在形式。

铜的易交换形态在某些病理条件下可能显著增加，例如在遗传性威尔逊病中，由于铜的过量积累而导致的铜代谢紊乱，或在铜中毒的情况下。此外，在某些特定的生物部位，如突触间隙中，铜的浓度可能高达200–250 μM。值得注意的是，铜的高浓度也与一些神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病有关。因此，准确测量铜的易交换池对于理解铜的生物学行为以及监测与铜相关的疾病具有重要意义。

镍与铜类似，其在生物系统中的行为也受到多种因素的影响。虽然镍对人类并非必需，但其在某些微生物和植物中的作用不可忽视。镍与铜一样，能够与生物分子形成稳定的配位复合物。ATCUN（Amino Terminal Copper and Nickel binding motif）是一种经典的铜和镍结合位点，其序列定义为H?N-Xxx-Zzz-His（其中His代表组氨酸，Xxx和Zzz为天然氨基酸，且Zzz不包括脯氨酸）。ATCUN序列在人血清白蛋白的N端存在，是铜和镍选择性结合的典型例子。该配体能够与铜形成高度稳定的四配位复合物，其结合常数（log Kd，在pH 7.4条件下）约为12–15，这种稳定性使其在广泛的pH范围内保持功能。对于镍，ATCUN的结合常数（log Kd，在pH 7.4条件下）约为6–8，表明其与铜相比具有较低的结合亲和力。

鉴于ATCUN序列在铜和镍检测中的优异性能，研究人员已经开发出多种基于荧光的传感器，这些传感器利用ATCUN的特性，结合绿色发射的荧光染料，通过荧光淬灭效应来检测铜离子。然而，在复杂的生物介质中，如血清或尿液，这些荧光方法可能会受到内源性荧光背景的干扰，从而影响检测的准确性和可靠性。为了解决这一问题，研究团队开发了一种基于稀土元素铽（Tb3?）的“关断型ATCUN探针”，该探针通过天线效应实现对铽离子的敏化，其具有较长的发光寿命（约2毫秒），从而可以通过时间延迟检测（约100微秒）有效消除背景荧光的干扰。然而，稀土元素的发光强度较弱，容易受到生物介质中内滤效应的影响，这限制了其在复杂生物环境中的应用。

为了克服上述限制，研究人员转向了基于1?F核磁共振（NMR）技术的探针设计。1?F NMR具有较高的灵敏度和选择性，特别是在生物介质中，由于天然生物分子中缺乏氟，1?F信号可以有效地排除背景干扰。基于这一原理，研究团队设计并合成了基于ATCUN的1?F标记肽探针，用于选择性和可逆性地检测铜和镍。这些探针通过1?F NMR技术实现对金属离子的检测，具有较高的检测限和定量限，适用于研究与铜相关的病理情况。

在具体的设计过程中，研究人员选择了来源于ATCUN序列的肽1a，其序列为GGH。通过引入一个色氨酸（Trp）残基在第四个位置，利用优化的Langlois方法，实现了对色氨酸吲哚环的直接C?-三氟甲基化，从而避免了在固相肽合成（SPPS）过程中引入非天然氨基酸。这种方法不仅提高了合成的效率，还确保了探针的结构稳定性和功能性。通过LC-MS和1?F NMR分析，研究人员确认了色氨酸的三氟甲基化修饰的成功，并进一步验证了该探针对铜和镍的选择性。

在检测过程中，研究人员利用1?F NMR技术监测了探针1b与铜离子的结合情况。结果表明，随着铜离子浓度的增加，探针的1?F信号逐渐减弱，这与顺磁性弛豫增强（PRE）效应有关。当加入过量的铜螯合剂EDTA后，信号得以恢复，表明探针具有可逆性。这一特性使得探针1b能够用于复杂生物环境中的动态监测，有效排除了由于探针降解或非特异性结合导致的信号变化。此外，研究人员还测试了探针1b在存在其他金属离子（如锌、铁、钴、锰、镁和钙）的情况下的选择性，结果表明只有铜和镍能够显著影响信号，进一步验证了ATCUN序列对这两种金属的高度选择性。

为了提高检测的灵敏度和准确性，研究团队进一步设计了双标记的探针2b。该探针在ATCUN序列中引入了第二个三氟甲基化的色氨酸残基，并通过插入一个刚性的六脯氨酸（PolyPro?）间隔子，使得两个色氨酸残基在空间上分离。这种设计有效减少了铜离子对远端色氨酸信号的影响，从而提高了检测的信噪比。通过1?F NMR分析，研究人员观察到探针2b在与铜结合时，其信号呈现明显的比率变化，这表明其能够通过不同的化学位移来区分自由和结合状态的探针。此外，当加入EDTA后，信号得以恢复，进一步证明了探针的可逆性。

在复杂的生物介质中，如DMEM细胞培养基，探针2b表现出良好的稳定性，能够成功检测铜离子的存在。研究人员在存在多种生物干扰物质和竞争配体的情况下，验证了探针的检测能力，表明其在生物相关环境中的适用性。探针2b能够检测低至50 μM的铜离子浓度，这一灵敏度对于研究铜相关的病理情况具有重要意义。

通过这些研究，研究人员开发了一种基于1?F NMR的比率型探针，用于检测生物介质中的铜和镍。这种探针不仅具有良好的选择性和可逆性，而且能够有效排除背景干扰，适用于复杂的生物系统。此外，研究还表明，通过优化ATCUN序列，可以提高探针的稳定性和检测灵敏度，使其在生物相关环境中具有更广泛的应用前景。

这些研究成果为金属离子的检测提供了一种新的方法，尤其是在那些难以使用荧光技术进行检测的复杂生物介质中。1?F NMR探针的开发不仅有助于理解金属离子的生物行为，还为相关疾病的诊断和治疗监测提供了可靠的工具。此外，该方法的非侵入性和高灵敏度使其在生物医学研究中具有重要的应用价值。

综上所述，基于ATCUN的1?F标记肽探针的开发和应用，为金属离子的检测提供了一种新的策略。通过优化探针设计，研究人员成功实现了对铜和镍的高选择性和可逆性检测，同时克服了传统荧光方法在复杂生物介质中的局限性。这一进展不仅推动了金属离子检测技术的发展，还为理解金属离子在生物系统中的行为提供了新的视角。未来，随着技术的进一步完善和应用范围的扩大，基于1?F NMR的探针有望在生物医学领域发挥更大的作用。