Novosphingobium芳香烃降解菌中新型多底物芳香激酶MarK的发现及其在木质素衍生芳香化合物代谢中的关键作用

研究人员针对木质素解聚产物乙酰香兰酮(acetovanillone)难以被微生物降解的问题，通过实验室适应性进化培育出Novosphingobium aromaticivorans DSM12444突变株，发现单氨基酸突变(E16K)可激活新型多底物芳香激酶MarK的功能。该研究首次揭示了广泛存在的UPF0261蛋白结构域的催化活性，解析了1.57 ?晶体结构，证实MarK E16K能以1600倍速率提升催化乙酰香兰酮磷酸化，为木质素衍生芳香化合物的生物转化提供了新工具。

　　

在追求可持续发展的今天，利用可再生资源生产高附加值化学品成为全球关注焦点。木质素作为植物细胞壁的主要成分，是自然界最丰富的芳香聚合物之一，其解聚产物可替代石油来源的芳香化合物。然而，木质素解聚产生的乙酰香兰酮(acetovanillone)等修饰芳香化合物却难以被大多数微生物降解，这成为生物炼制过程中的关键瓶颈。

传统化学法解聚木质素会产生复杂的芳香化合物混合物，其中乙酰香兰酮在多种解聚工艺中含量高达第二或第三位。虽然某些细菌如Pseudomonas putida和Rhodococcus opacus能降解部分芳香化合物，但对乙酰香兰酮却束手无策。Novosphingobium aromaticivorans DSM12444作为芳香化合物降解菌，虽能代谢香兰醛(vanillin)等结构类似物，却同样无法利用乙酰香兰酮作为唯一碳源生长。

为突破这一限制，研究人员采用实验室适应性进化策略，通过逐步提高培养基中乙酰香兰酮比例，成功获得能高效利用该化合物的突变菌株。全基因组测序揭示所有进化菌株均在Saro_1862基因出现相同突变，导致其编码蛋白第16位谷氨酸被赖氨酸取代(E16K)。通过基因工程构建的定点突变株TD606证实，这一单氨基酸变化足以赋予细菌乙酰香兰酮代谢能力。

研究采用的主要技术包括：实验室适应性进化培养、全基因组测序分析、基因敲除和回补实验、蛋白质表达纯化、高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)分析、酶动力学测定、X射线晶体学解析1.57 ?分辨率蛋白结构，以及生物信息学分析比较不同细菌中相关基因的分布。

在"Laboratory evolution of acetovanillone-metabolizing strains of N. aromaticivoran DSM12444"部分，研究人员通过逐步提高乙酰香兰酮选择压力，获得三株独立进化菌株。全基因组测序发现所有菌株均在Saro_1862基因发生G→A突变，导致E16K氨基酸替换。通过同源重组构建的TD606菌株证实该突变是获得乙酰香兰酮代谢能力的充分必要条件。

"Saro_1862 is part of a predicted acetovanillone metabolism operon"部分显示，Saro_1862位于一个预测的乙酰香兰酮代谢操纵子中。基因敲除实验证明相邻的Saro_1861(acvC同源基因)和Saro_1858(acvF同源基因)对乙酰香兰酮代谢同样不可或缺，这与Sphingobium sp. SYK-6和R. rhodochrous GD02中报道的代谢途径一致。

"Saro_1862 encodes an acetovanillone kinase"部分通过体外实验证实，纯化的重组MarK E16K能在ATP存在下将乙酰香兰酮转化为磷酸化产物，并通过HPLC检测到ADP生成。酶动力学分析显示E16K突变使催化速率提升约1600倍，从野生型的0.041 min^-1增至64 min^-1。

"MarK E16K phosphorylates aromatic ketones and aldehydes in vitro"部分拓展了该酶的底物谱，发现其能磷酸化三大类木质素衍生芳香化合物(S/G/H型)，尤其对含酮基或醛基的底物表现出偏好。HPLC-MS分析证实其对乙酰香兰酮、乙酰丁香酮(acetosyringone)等12种芳香化合物具有磷酸化活性。

"MarK E16K is required for growth on ketone-substituted aromatics"部分通过生长实验证明，MarK E16K对细菌利用乙酰香兰酮、愈创木基丙酮(guaiacylpropanone)和对羟基苯乙酮(p-hydroxyacetophenone)等酮基取代芳香化合物至关重要，但对某些体外能磷酸化的底物(如乙酰丁香酮)却不能支持生长，表明代谢途径存在更复杂的调控。

"Structure of MarK E16K"部分解析的1.57 ?晶体结构揭示MarK为同源二聚体，每个单体包含N端和C端两个亚结构域。C端亚结构域中存在明确的乙酰香兰酮结合口袋，通过氢键和π-π堆积相互作用稳定底物。结构比对提示N端亚结构域可能结合ATP，E16K突变位于潜在的ATP结合位点附近。

"Presence of MarK homologs across phylogeny"部分的生物信息学分析发现，266个细菌基因组含有MarK同源基因且具备完整的乙酰香兰酮代谢基因簇，这些菌株广泛分布于α-变形菌纲、放线菌门和厚壁菌门中。值得注意的是，约25%的基因组同时编码MarK和异源二聚激酶AcvAB/HpeHI的同源基因，暗示某些细菌可能通过两种激酶拓展底物范围。

研究结论指出，这是首次揭示UPF0261蛋白结构域具有催化活性，将其命名为多底物芳香激酶MarK。E16K突变通过显著提升磷酸化速率，使细菌获得代谢乙酰香兰酮等酮基取代芳香化合物的能力。晶体结构分析为理解催化机制提供了分子基础，而广泛的系统分布预示MarK同源蛋白可能在多种细菌的芳香化合物代谢中发挥重要作用。

这项研究的意义在于：为木质素 valorization(高值化利用)提供了新的酶工具；揭示了UPF0261这一广泛存在但功能未知的蛋白家族的首个催化活性；通过单氨基酸改造大幅提升酶活性的策略为蛋白质工程提供了范例；发现的代谢途径可应用于设计高效降解木质素衍生芳香化合物的工程菌株。这些发现将促进可再生芳香化合物的生物制造，助力绿色化学和可持续发展目标的实现。