古生菌Pyrococcus furiosus中交替NAD+依赖性NADPH:铁氧还蛋白氧化还原酶II（NfnII）高电位分支的电子分叉门控机制研究

研究人员针对古生菌代谢中电子分叉机制的关键调控问题，对Pyrococcus furiosus的NADPH:铁氧还蛋白氧化还原酶II（NfnII）开展动力学研究。通过瞬态吸收光谱和快速反应动力学技术，发现其S-FAD半电位交叉程度比同源酶NfnI更高（>120 mV），导致高电位通路电子传递受阻。该研究首次揭示电子分叉活性受高电位分支门控的分子机制，为理解古生菌能量代谢多样性提供新视角。

　　

在极端环境中生存的古生菌Pyrococcus furiosus演化出了精妙的能量代谢系统，其中电子分叉（electron bifurcation）机制能将一对中电位电子拆分为高、低电位两路，为细胞提供能量和还原力。这种机制的核心是含有特殊黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的酶系统，但令人困惑的是，该菌体内存在两个高度同源的NADPH:铁氧还蛋白氧化还原酶（NfnI和NfnII），尽管结构相似，NfnII却表现出显著降低的分叉活性。这种功能差异的分子基础及其生理意义，成为理解古生菌代谢调控的关键科学问题。

为揭示这一谜题，加州大学河滨分校的Steve Ortiz团队在《Journal of Biological Chemistry》发表研究，通过多尺度实验技术解析了NfnII的独特工作机制。研究人员采用稳态滴定（NADPH/连二亚硫酸钠为还原剂）、毫秒级快速反应动力学（Applied Photophysics SX-20停流仪）、瞬态吸收光谱（400 nm泵浦-探测技术）和电子顺磁共振（15K低温EPR）等方法，系统比较了NfnII与NfnI的电子传递特性。

Reductive titrations of NfnII with NADPH and sodium dithionite

稳态滴定实验显示，与NfnI不同，NfnII在还原过程中几乎不积累S-FADH•半醌（500-600 nm无特征吸收），且NADPH无法将其完全还原。定量分析表明S-FAD的两个半电位（E₁和E₂）交叉程度至少达120 mV，导致半醌态热力学不稳定。

The rapid-reaction kinetics of NfnII reduction by NADPH

快速反应动力学揭示，虽然L-FAD初始还原速率与NfnI相当（k_obs≈61 s^-1），但后续电子传递显著受阻。光谱分析证实高电位通路仅能接受单电子（[2Fe-2S]簇还原），无法像NfnI那样通过S-FAD传递多电子。

Ferredoxin reduction by NfnII

铁氧还蛋白还原实验证实NfnII仅能催化单次分叉事件（1 eq Fd_red），而NfnI可还原3 eq。EPR检测到[4Fe-4S]簇的持续还原信号，进一步验证高电位通路阻塞是分叉活性受限的主因。

Transient Absorption Spectroscopy on NfnII

飞秒级瞬态光谱发现NfnII的L-FAD仍能生成寿命7 ps的FAD•^-中间体，证明其分叉能力完整。但S-FAD因His220取代NfnI的Asn218，通过π-π相互作用改变 flavin 电子结构，最终导致高电位通路"电子闸门"关闭。

这项研究首次阐明电子分叉酶的功能差异源于高电位分支的电子传递门控。在生理层面，NfnII进化为非分叉型NADPH生成器，与NfnI形成功能分工：NfnI在糖酵解中协调NAD⁺/NADP⁺平衡，而NfnII在肽类代谢中专职提供还原力。这种机制为理解极端微生物的能量分配策略提供了新范式，也为设计人工电子传递链提供了理论依据。