单细胞多组学解析小鼠胚胎植入前复制时序与基因表达的独特调控模式

本研究针对早期小鼠胚胎中复制时序(RT)与基因表达的调控关系这一科学难题，开发了单细胞多组学(sc-multiomics)技术，首次在1-cell、2-cell和4-cell胚胎中同步分析RT与转录组。研究发现RT在受精卵阶段已建立，且与体细胞不同，晚期复制区域与高基因表达和开放染色质相关。该成果发表于《Communications Biology》，为理解胚胎发育表观遗传调控提供了新视角。

　　

在生命起始的奥秘中，胚胎如何协调DNA复制与基因表达一直是发育生物学的核心问题。复制时序(RT)作为表观遗传调控的重要维度，在体细胞中已被证实与基因表达、染色质可及性密切相关。然而，对于具有独特核结构的全能性胚胎，特别是小鼠植入前胚胎中RT的建立规律及其与合子基因组激活(ZGA)的时空关系，仍存在激烈争议——四项近期研究分别报道了"受精卵阶段RT已建立""2-cell阶段才出现"甚至"完全缺失"等矛盾结论。这种认知鸿沟的背后，是技术层面的双重限制：传统方法无法在单细胞水平同步获取RT与转录组数据，而早期胚胎样本稀缺性更增加了研究难度。

为破解这一难题，明尼苏达大学Anala V. Shetty团队在《Communications Biology》发表创新性研究。研究人员开发了低起始量(10细胞)的单细胞多组学技术，对体内受精的1-cell、2-cell和4-cell胚胎进行同步RT与转录组分析。通过整合ATAC-seq参考数据，首次揭示了早期胚胎中RT与基因表达的"反常识"关联：与体细胞中"早期复制区域高表达"的经典认知相反，晚期复制区域反而呈现更高基因表达和开放染色质状态。这一发现为理解全能性细胞的表观遗传调控提供了全新范式。

关键技术方法包括：1)体内受精胚胎的单细胞分离技术；2)可同步提取gDNA和mRNA的sc-multiomics建库方案；3)基于Kronos管线的单细胞RT分析；4)整合Seurat和Monocle3的多组学数据联合分析。样本来源于20只C57BL/6小鼠的体内受精胚胎，分别获取36个1-cell、42个2-cell和43个4-cell单细胞。

RT在1-cell阶段已建立并随发育逐渐精细化

伪批量分析显示1-cell胚胎已存在保守的RT模式，与参考数据集有70%一致性。随着胚胎发育，复制域从1-cell的大片段(400-800kb)逐渐缩小为4-cell的精细结构。SPRING算法构建的RT轨迹显示，4-cell胚胎细胞分布在1-cell与2-cell集群之间，反映发育连续性。

晚期复制区域与高基因表达相关

扣除母源mRNA干扰后，2-cell和4-cell阶段晚期复制基因表达量显著高于早期复制基因(p<0.01)。单细胞层面分析证实，87.5%的2-cell胚胎细胞呈现这种"负斜率"关联。这与体细胞HepG2系的"正斜率"趋势形成鲜明对比，暗示全能性细胞具有独特的表观调控逻辑。

RT转换与染色质动态重塑协同调控

基因组聚类发现早期到晚期的RT转换均伴随基因表达上调和染色质开放(ATAC值增加)。2-cell阶段出现全基因组范围的染色质"爆发式"开放，与主要ZGA事件同步；而到4-cell阶段，部分区域恢复封闭状态，预示异染色质开始形成。

多组学整合轨迹再现发育进程

联合scRT与scRNA数据的伪时间分析成功重建了从1-cell到4-cell的发育轨迹，各阶段细胞形成特征性集群，验证了多组学数据的生物学一致性。

这项研究确立了三个里程碑式发现：首先，RT程序在转录爆发前的1-cell阶段就已建立，挑战了"转录指导RT"的传统观点；其次，揭示了全能性细胞特有的"晚期复制-高表达"调控模式，为理解早期胚胎表观遗传重编程提供了新维度；最后，通过多组学整合证实RT转换与染色质动态存在精确协同。这些发现不仅解决了领域内长期争议，其开发的sc-multiomics技术更为稀有样本的表观遗传研究提供了通用工具。

值得关注的是，研究提出的"染色质液态性"假说为异常调控提供了新解释：早期胚胎中异染色质的流动性可能允许晚期复制区域保持开放状态，而随着发育进行，逐渐固化的核结构使体细胞获得经典RT模式。该理论为理解癌症等疾病中RT紊乱现象提供了进化视角。未来研究可进一步探索母源mRNA对RT建立的贡献，以及这种特殊调控模式在多能性转换中的命运决定作用。