单等位基因HLA-II类免疫肽组平台的构建及其在治疗性蛋白免疫原性评估中的应用

本研究针对生物治疗蛋白免疫原性评估的关键挑战，开发了一种单等位基因HLA-DRB1 B细胞平台，通过工程化改造构建了15种HLA-DRB1单等位基因B细胞系，结合通用BCR技术实现多种IgG亚型的免疫肽组分析。该平台成功解析了阿达木单抗(adalimumab)等治疗抗体的T细胞表位限制性，首次发现半胱氨酸修饰的等位基因特异性呈现模式，为精准评估不同人群免疫风险提供了新工具。研究发表于《Communications Biology》，为生物药开发中的免疫原性风险评估提供了标准化解决方案。

　　

在生物制药领域，治疗性蛋白引发的免疫原性反应是影响药物安全性和有效性的关键因素。当人体将外源治疗蛋白识别为"入侵者"时，会产生抗药抗体(ADA)，轻则降低药效，重则引发致命性过敏反应。历史上已有多个惨痛教训：促红细胞生成素导致纯红细胞再生障碍，α-葡萄糖苷酶治疗庞贝病引发肾病综合征等。这些案例凸显了准确评估治疗蛋白免疫原性的迫切需求。

问题的核心在于人类白细胞抗原II类分子(HLA class II)的极端多态性。这些分子像特洛伊木马般在抗原呈递细胞(APC)表面展示蛋白片段，供CD4⁺ T细胞识别。大多数人是HLA-DRB1基因的杂合子，且存在DRB3/4/5等旁系同源基因，使得精确确定肽段呈现的等位基因限制性成为巨大挑战。传统方法使用单核细胞来源的树突细胞(MDDCs)，但受限于供体HLA型别的随机性，无法系统评估不同人群风险。此外，B细胞作为天然APC，因其B细胞受体(BCR)的抗原特异性限制，一直未能成为通用技术平台。

为解决这些瓶颈，Eli Lilly公司的Robert W. Siegel团队在《Communications Biology》发表创新研究。他们通过基因工程构建了革命性的单等位基因HLA-DRB1 B细胞平台：首先利用CRISPR技术敲除Raji B细胞系的内源性HLA-DRB基因；然后引入能结合所有人IgG亚型的通用BCR（基于小鼠杂交瘤可变区与人IgD恒定区）；最后重建15种HLA-DRB1等位基因，覆盖美日人群>90%的个体。技术关键还包括：流式细胞术验证表面表达、质谱免疫肽组分析(MAPPs)、NetMHCIIpan-4.3算法预测结合核心、Allele Frequency Net Database计算人群频率等。

【平台构建与验证】

研究团队首先通过CRISPR-Cas9系统成功敲除了Raji细胞的内源性HLA-DRB1 * 03:01和*10:01等位基因，Western blot和测序证实敲除效果。随后构建的嵌合BCR能有效内化IgG1/2/4等多种亚型抗体，质谱分析显示15个HLA-DRB1单等位基因细胞系均能呈递抗体恒定区肽段。特别值得注意的是，该系统在1-100μg/mL的宽浓度范围内保持稳定的肽段呈现模式，且连续培养20代后仍保持高度可重复性。与MDDCs的对比实验证实，该平台能重现已知免疫原性抗体ATR-107的所有HLA-II类肽段簇。

【阿达木单抗人群风险分析】

应用该平台分析全球畅销药阿达木单抗，发现221个可变区肽段呈现明显的等位基因限制性。其中H3-1簇(VH 87-106)呈现最广泛的人群风险差异：美国人群66%、日本人群95%的个体可能通过HLA-DRB1 * 01:01等8个等位基因识别该表位。研究还鉴定出5个含非种系残基的T细胞表位簇，与临床报道的ADA阳性患者表位完全吻合。值得注意的是，HLA-DRB1 * 07:01（美国人群22%）能呈递3个表位，而日本人群高频等位基因HLA-DRB1 * 09:01（27%）可呈递4个表位。

【半胱氨酸修饰新发现】

研究首次报道了抗体肽段中半胱氨酸(Cys)修饰的等位基因特异性现象。在未进行还原/烷基化处理的质谱分析中，30%的Cys肽段存在三氧化或胱氨酸化修饰。令人惊讶的是，相同肽段在不同HLA-DRB1等位基因上呈现截然不同的修饰状态：如阿达木单抗FR3-H3簇(88-109)肽段在HLA-DRB1 * 01:01上全部未修饰，而在HLA-DRB1 * 13:01中13/14肽段被氧化。结合NetMHCIIpan预测，这些修饰可能影响肽段与HLA结合或TCR识别的模式。

这项研究构建了首个覆盖主要人群HLA多态性的单等位基因免疫肽组平台，解决了生物药开发中免疫原性评估的标准化难题。通过精确量化不同等位基因的肽段呈现模式，可预测特定人群的ADA风险，指导临床用药策略。发现的Cys修饰现象为理解HLA-II类分子抗原加工提供了新视角，提示未来表位预测算法需整合修饰信息。该平台还可扩展应用于疫苗设计、自身免疫病等研究领域，为精准医疗提供重要工具。