HybriSeq技术：基于多探针杂交的单细胞RNA高灵敏度检测新方法

研究人员针对单细胞RNA测序(scRNAseq)检测效率低(5%-45%)、存在3'端偏好性等问题，开发了基于原位杂交和分裂池条形码技术的HybriSeq方法。该方法通过多探针设计实现线性信号放大，在PBMC中成功检测196个基因的细胞异质性，灵敏度达传统方法的22倍，同时揭示了转录本注释缺失现象，为单细胞研究提供了高性价比的新工具。

　　

在生命科学研究中，单细胞RNA测序(scRNAseq)已成为解析细胞异质性和基因调控网络的重要工具。然而传统方法存在明显局限：依赖poly(A)尾捕获导致非poly(A)RNA漏检，逆转录效率低下造成5%-45%的检测丢失，特别是对低丰度转录本的检测如同"大海捞针"。更棘手的是，现有技术存在3'端偏好性，难以全面反映转录本全长信息。这些问题严重制约了单细胞研究的精度和深度，亟需开发新型检测方法。

针对这些挑战，Daniel Foyt等研究团队在《Communications Biology》发表了创新性解决方案——HybriSeq技术。该方法巧妙结合了单分子荧光原位杂交(smFISH)的高灵敏度优势与高通量测序技术，通过多探针设计实现信号线性放大。研究团队首先优化了探针杂交和连接体系，采用SplintR连接酶确保特异性，随后通过两轮分裂池条形码和索引PCR实现单细胞标记。整个流程无需微流控设备，成本降至每个细胞1.4美分，仅为商业方案的1/7。

关键技术方法包括：1)设计30nt靶向探针对，通过SplintR连接酶实现RNA依赖的特异性连接；2)建立三轮分裂池条形码标记体系(共884,736种组合)，实现微流控-free的单细胞分辨；3)优化杂交条件(30%甲酰胺，37℃ 24小时)和连接效率；4)使用PBMC样本验证技术性能。实验设计严谨，包含HEK293与Do-11-10细胞混合实验、6个基因的全长探针覆盖实验等系统验证。

【Development and validation of HybriSeq】部分显示，该方法在HEK293与小鼠T细胞混合实验中仅产生3.6%的双峰率，显著低于液滴系统。与bulk RNA-Seq数据相关性达r=0.90，证实定量准确性。引人注目的是，当使用3个探针/转录本时，相关性明显优于1-2个探针，验证了多探针设计的优势。

【Variability of probe detection efficiency】部分通过对6个基因的全长探针覆盖分析，发现大多数探针检测效率稳定，但EIF2S2和GHITM转录本的3'端区域存在系统性低覆盖。进一步实验证实这与探针可及性无关，而是反映了现有转录本注释的缺失。这一发现为基因组注释完善提供了新线索。

【Linear signal amplification using multiple probes】部分建立了数学模型，证明HybriSeq通过多探针设计可将信噪比(SNR)提升√n倍(n为探针数)。实验数据显示，使用4个探针时NEFH基因检测下限可达1-2个转录本/细胞，较传统方法提升8-40倍。这种"集腋成裘"的策略有效解决了低丰度RNA检测难题。

【Analyzing PBMC activation with HybriSeq】部分应用该方法成功解析了11,148个PBMC在CD3/CD28刺激下的转录动态。数据揭示特定T细胞亚群在激活24小时后出现独特的IFNG表达模式，展现了技术在免疫研究中的应用潜力。特异性连接事件占比>98%，远超非特异性背景。

研究结论指出，HybriSeq通过三大创新点推动了单细胞技术发展：1)多探针线性放大使低丰度RNA检测极限降低一个数量级；2)非poly(A)依赖机制拓展了检测范围；3)全长覆盖能力可发现转录本注释错误。这些优势使其在稀有细胞鉴定、转录变异分析等领域具有独特价值。尽管存在短RNA检测受限、多步操作导致信号损失等局限，但其高性价比(1800 reads/细胞即达0.8饱和率)和易操作性为大规模单细胞研究提供了新选择。该工作为Zev J. Gartner和Bo Huang团队在单细胞技术领域的又一重要突破，其揭示的转录本注释问题也为基因组学研究开辟了新方向。