基于预算调整法的混合物毒性评估中日间变异性校正策略研究

本研究针对混合物毒性评估中存在的日间变异性问题，提出创新性的预算调整法（Budget approach）。团队通过建立固定比例混合物响应曲线，结合Loewe相加性模型，开发了基于EC20参考值的校正方法。研究发现10种物质混合时呈现负交互作用（less than additive effect），为复杂环境暴露风险评估提供了新方法学支持。该成果发表于毒理学顶级期刊《Archives of Toxicology》，对提高混合物毒性测试的可重复性具有重要意义。

　　

在现代社会，人类每天都会接触到数百种化学物质的复杂混合物，从药品到环境污染物，这些物质可能通过"多头龙效应"（multi-headed dragon effect）产生联合毒性。然而传统的毒理学风险评估主要关注单一物质，对混合物效应的研究仍存在重大缺口。更棘手的是，体外实验中的"日间变异性"（day-to-day variability）问题严重影响了混合物毒性评估的可靠性——同样的物质在不同实验批次中可能表现出不同的细胞毒性，这使得基于历史数据的混合物实验面临严峻的重复性挑战。

针对这一难题，Franziska Kappenberg领衔的国际研究团队在《Archives of Toxicology》发表重要成果。研究人员开发了一套创新的"预算调整法"，通过校正日间变异性，显著提高了混合物毒性评估的准确性。该方法特别适用于评估"反抗小矮人效应"（Revolting Dwarfs）——即大量低剂量物质可能产生的协同毒性现象。

研究团队采用三项关键技术：1）基于4参数log-logistic（4pLL）模型的浓度-响应曲线拟合，从至少3个独立实验中确定EC₂₀中位值；2）固定比例射线设计（fixed-proportion ray design），测试8种不同混合比例的细胞活力；3）创新的预算调整算法，通过比较参考EC₂₀与当日特异性活力值（day-specific viability）来校正日间变异。所有实验均使用HepG2细胞系和CellTiter-Blue（CTB）活力检测法。

【Estimation of the reference EC₂₀】

研究人员首先建立了参考EC₂₀测定标准：通过4pLL或Brain-Cousens模型拟合浓度-响应曲线，要求最高测试浓度下的细胞活力<90%，拟合优度>0.55。以对乙酰氨基酚（APAP）等10种物质为例，其中丙戊酸（VPA）的参考EC₂₀为1.4 mM，展现了方法的高度物质适用性。

【Fitting of mixture curves】

创新性地采用射线设计，将各物质的参考EC₂₀按固定比例（1/128至1倍）混合。每个比例设置4个技术重复，通过4pLL模型拟合混合物比例-响应曲线。这种设计有效解决了多物质混合时的溶解度限制问题。

【Budget approach】

研究提出"毒性预算"概念：假设n种物质各按1/n比例混合时，若为纯相加效应（Loewe additivity），混合物在1/n比例处应产生80%活力值。如图1所示，10种物质混合时，0.1比例对应80%活力为相加效应（A），低于80%为协同效应（B），高于80%则为拮抗效应（C）。

【Adjustment for day-to-day variability】

针对日间变异，团队开发了两种校正算法："责任曲线法"（Responsible）仅使用决定EC₂₀中位数的参考曲线；"中位数法"（Median）则综合所有参考曲线。如图6所示，以苯丁酸钠（SPB）为例，当日特异性活力为65.03%时，校正后的浓度从8.3 mM调整为10.60 mM，预算从100%增至128%。

【Application】

实际应用显示，10种物质混合时三批实验的预测活力分别为95.9%、87.4%和85.6%，均高于85%的阈值，表明存在显著负交互作用（negative interaction effect）。值得注意的是，VPA在校正后预算仅17%，揭示其当日细胞毒性显著低于参考实验。

这项研究在方法论上有三大突破：首先，预算调整法首次系统解决了混合物毒性评估中的日间变异问题；其次，将Loewe相加性模型扩展至多物质（达10种）混合场景；最后，建立了[75%,85%]的等效区间来判定交互作用类型。正如讨论部分指出，该方法特别适用于评估"反抗小矮人"假说——大量低剂量物质可能产生的健康风险。虽然目前主要应用于药物毒性评估，但该框架可轻松扩展至环境污染物混合物研究。研究提供的开源代码（GitHub可获取）更将促进方法学的广泛应用，为复杂暴露情境下的风险评估提供新工具。