通过混合培养发酵解除D-乳酸对丙酸产生的抑制作用

《Journal of Water Process Engineering》：Relieving the inhibition of propionate production by D-lactic acid via mixed culture fermentation

D-乳酸光旋性对混合培养发酵产丙酸的影响及菌群调控机制研究。混合培养缓解了D-乳酸100%光旋性抑制，丙酸产量达8.4-8.5g/L，丝兰属菌主导酸途径，阿卡里基因氏菌通过琥珀酸途径产丙酸，D-LDH活性增强是关键机制。

　　

尹俊|陈明阳|金建宇|陈志强|唐秀娟|陈婷

中国浙江省工商大学环境科学与工程学院固体废物污染控制与资源化利用重点实验室，杭州310012

摘要

Propionibacterium acidipropionici将D-乳酸生物转化为丙酸的过程中受到光学活性（OA）的抑制；然而，这种抑制在混合培养发酵（MCF）中是否普遍存在尚不清楚。在本研究中，我们使用光学活性为0%和100%的D-乳酸进行了丙酸生产的实验。混合培养显著减轻了D-乳酸对丙酸生产的抑制作用。当D-乳酸的光学活性为100%时，丙酸产量为8.4 ± 0.4 g/L，占总挥发性脂肪酸的73.2%。当D-乳酸的光学活性为0%时，产量（8.5 ± 0.1 g/L）和比例（74.0%）没有显著差异。在D-乳酸光学活性为0%的情况下，优势菌属Serpentinicella通过丙烯酸途径产生丙酸；而当光学活性为100%时，Serpentinicella的丰度显著下降，通过琥珀酸途径产生丙酸的Alcaligenes的丰度增加。D-乳酸脱氢酶活性的增强是D-乳酸进入琥珀酸途径的前提条件。本研究展示了混合培养的优势，并为丙酸生产提供了理论基础和技术支持。

引言

丙酸是一种重要的基础化学品，广泛应用于食品、饲料、制药、塑料和化妆品行业[1]。目前，全球市场上销售的丙酸主要通过轻质烃氧化、Reppe工艺和丙醛氧化从原始石油原料合成[2]。然而，石化路线消耗大量能源并造成二次污染；因此，需要寻找更环保的替代方案。随着生物技术的发展，生物工艺与化学工艺之间的成本差距缩小，使得通过微生物发酵生产丙酸成为可能。

微生物发酵可以将复杂的有机底物转化为目标产物；然而，目标产物的获得取决于底物、接种物和发酵过程中的环境条件[[3],[4],[5]]。先前的研究报道了使用乳酸作为丙酸生产底物的优势[[6],[7],[8]]。乳酸有三种形式：D-乳酸、L-乳酸和外消旋混合物（DL-乳酸）[9]。很少有研究报道乳酸构型对丙酸生产的影响。Li等人[10]报告称，D-乳酸的光学活性增加导致Propionibacterium acidipropionici产生的丙酸量从6.85 g COD/L下降到3.42 g COD/L，且D-乳酸的消耗量远低于L-乳酸，表明D-乳酸抑制了丙酸的生产[10]。根据Guan等人对丙酸合成关键代谢节点的代谢组学分析，P. acidipropionici通过丙酮酸途径合成丙酸的途径是琥珀酸途径[11]。负责将L-乳酸和D-乳酸转化为丙酮酸的酶分别是NAD依赖的L-乳酸脱氢酶（L-LDH）和NAD依赖的D-乳酸脱氢酶（D-LDH）[12]。因此，我们推测P. acidipropionici受到D-乳酸抑制的主要原因是D-LDH活性的缺乏或抑制；然而，这种抑制在混合培养中是否普遍存在尚不清楚。混合培养发酵（MCF）可以利用复杂底物，并降低灭菌和维护成本。与纯培养发酵相比，MCF具有多种优势[[13],[14],[15],[16]]。

本研究的目的是探讨D-乳酸是否仍然在混合培养中抑制丙酸的生产。首先，评估了D-乳酸光学活性对混合培养中丙酸生产的影响，并测定了D-LDH的活性。然后，分析了不同光学活性下的微生物群落结构和差异微生物属。最后，利用京都基因与基因组百科全书（KEGG）的功能预测分析，提出了一种可能的缓解机制。

不同光学活性下的D-乳酸发酵实验

两个发酵反应器中的D-乳酸光学活性分别为0%和100%，总乳酸浓度为15 g/L。接种物来自中国山东某污水处理厂的厌氧颗粒污泥，添加比例为每克总悬浮固体5克乳酸。在发酵过程中添加了营养物质；其组成和最终浓度的详细信息见Chen等人的研究[17]。

D-乳酸光学活性对丙酸生产的影响

图1显示了光学活性为0%和100%时发酵过程中挥发性脂肪酸（VFA）的产生和组成。当D-乳酸的光学活性为0%时，第7天的丙酸产量最高，为8.5 ± 0.1 g/L，VFA浓度为11.5 ± 0.3 g/L；当光学活性为100%时，第5天的丙酸产量最高，为8.4 ± 0.4 g/L，VFA浓度为11.4 ± 0.1 g/L。

结论

D-乳酸光学活性的增加对混合培养中的丙酸生产没有抑制作用。当D-乳酸的光学活性从0%增加到100%时，丙酸的产量和分布没有显著差异。当D-乳酸的光学活性为100%时，Serpentinicella在微生物群落中的生长受到抑制，通过琥珀酸途径产生丙酸的Alcaligenes的丰度增加，D-LDH的活性增强，这为

CRediT作者贡献声明

尹俊：撰写 – 审稿与编辑，资金获取。陈明阳：撰写 – 原稿撰写，实验研究，数据管理。金建宇：数据可视化，软件应用。陈志强：数据可视化，资源管理，方法学设计。唐秀娟：数据可视化，实验监督，形式化分析。陈婷：结果验证，实验监督，资金获取，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢浙江省科学技术厅（项目编号：2023C03G2072956）和国家自然科学基金（项目编号：22376186）对本项目的资金支持。