基于稳定同位素二甲基标记和LC-MS/MS技术的灭活副干酪乳杆菌NTU 101后生元质量控制方法开发

本研究针对灭活益生菌（后生元）在复杂基质中质量控制(QC)的难题，创新性地建立了基于稳定同位素二甲基标记和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的定量检测方法。研究人员以灭活副干酪乳杆菌NTU 101为模型，筛选出50S核糖体蛋白L7/L12和细胞壁水解蛋白p40的特征肽段，通过多重反应监测(MRM)实现0.5-100 ng/mL范围的精准定量，在奶粉基质中回收率达87.99-108.72%。该研究为后生元标准化提供了可靠的分析工具。

　　

随着益生菌市场的蓬勃发展，后生元（postbiotics）——即非活性微生物及其成分组成的功能性物质——因其稳定的储存特性和明确的健康功效逐渐崭露头角。然而，热灭活益生菌在复杂食品基质中的质量控制始终面临重大挑战：传统菌落计数法无法检测死细胞，流式细胞术(FCM)和定量PCR(qPCR)虽能区分活死细胞，却存在分类分辨率低或DNA干扰等问题。更棘手的是"可存活但不可培养状态"(VBNC)的细菌，它们可能潜伏在产品中伺机复苏。这些瓶颈严重制约着后生元产业的标准化进程。

为此，来自台湾SunWay Biotech的研究团队在《LWT》发表了一项突破性研究。他们以具有免疫调节功能的灭活副干酪乳杆菌NTU 101为对象，开创性地将蛋白质组学技术应用于后生元质量控制。研究通过稳定同位素二甲基标记结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)，建立了双重保障体系：既通过特征肽段实现菌株鉴别，又能精准量化功能蛋白。这项技术不仅解决了复杂基质中微量成分的检测难题，更为后生元标准化提供了可量化的科学依据。

研究采用三大关键技术：首先通过LTQ Orbitrap Elite系统进行非标记定量蛋白质组学分析，评估批次一致性；其次利用稳定同位素(¹³CD₂O)二甲基标记合成肽段作为内标；最后采用三重四极杆质谱(Triple Quad 6500+)进行多重反应监测(MRM)定量。实验样本来自三批经75℃热处理30分钟的NTU 101菌体，并通过FCM验证完全灭活。

验证益生菌灭活效果

通过流式细胞术结合PI/SYTO 9双染色，确认热处理后样品中仅存在死细胞（PI阳性），且死细胞计数(约10¹² cells/g)与处理前活菌数一致，排除了VBNC状态细胞的存在。

蛋白质鉴定与批次一致性评估

三个批次(HK01-03)分别鉴定出858-880种蛋白质，Pearson相关系数达0.98-0.99。即使储存6个月后，蛋白质数量仍保持稳定，但相对丰度中位数下降至0.95-0.97，显示蛋白质缓慢降解的趋势。

特征肽段筛选

从丰度最高的5%蛋白质中，精选出两个标志物：具有分类鉴别意义的50S核糖体蛋白L7/L12（肽段AAAPVAAGAAAGADAAAAK），以及与肠道屏障功能相关的细胞壁水解蛋白p40（肽段ISSLSGEIVAAQK）。这两个肽段均符合无修饰、长度适中(13-19aa)、酶解稳定等质谱检测要求。

稳定同位素二甲基标记优化

在N端和赖氨酸ε-氨基引入二甲基标记，轻链(2CH₃)和重链(2¹³CD₂H)分别产生+56 Da和+68 Da的质量偏移。标记效率>99%，且轻重链肽段保留时间一致(偏差<0.01 min)，确保定量准确性。

方法学验证

在0.5-100 ng/mL范围内，L7/L12和p40肽段的线性度R²>0.995，检测限(LOD)分别为0.1和0.2 ng/mL。在奶粉基质中添加5%灭活菌体时，回收率达到87.99-108.72%，日内精密度CV<9%，完全符合ICH Q2(R1)标准。

实际样品分析

灭活菌粉中L7/L12和p40含量分别为1.341±0.020和0.993±0.020 mg/g（CV<2.01%）。通过肽段含量可换算原始菌粉添加量，如5%添加量的奶粉中相当于4.9×10¹⁰ CFU/g当量，为产品标示提供科学依据。

这项研究的意义在于建立了首个将分类鉴别与功能量化相结合的灭活益生菌检测体系。相比传统方法，该技术具有三大优势：能耐受复杂食品基质干扰、实现种水平特异性鉴别、直接检测功能蛋白而非替代标志物。特别是p40蛋白的定量，为研究热灭活后功能蛋白的稳定性开辟了新思路。

研究也指出当前局限：L7/L12仅能区分副干酪乳杆菌群（L. casei group），未来需开发更特异的肽段标记以支持多菌株配方。此外，蛋白质表达受培养条件影响，工艺变更时需重新建立基准值。这些发现不仅为后生元质量控制提供了切实可行的解决方案，也为功能食品标准化树立了新范式。随着该技术在工业界的推广应用，有望加速后生元从经验性产品向标准化生物制剂的转型。