肽段丰度相关性分析揭示人类肠道微生物组的分类与功能新视角

本研究针对复杂微生物群落中蛋白质互作机制不明的问题，通过质谱(MS)技术分析药物扰动下体外培养肠道菌群的肽段丰度相关性。研究发现同源肽段呈现显著共变特征，基于t-SNE构建的肽段相关性图谱可实现更高精度的基因组水平分类注释（如Bacteroidaceae科48.9%未注释肽段获得基因组归属），并通过物种特异性肽段丰度网络(TNPA)揭示了功能相关蛋白的协同调控机制。该研究为破解微生物"暗物质"功能提供了创新方法论，发表于《npj Biofilms and Microbiomes》。

　　

在人体这个"超级生物体"中，肠道微生物组犹如一座神秘的地下工厂，数万亿微生物通过复杂的代谢网络与宿主互动。尽管宏基因组学研究已绘制出微生物的基因蓝图，但真正执行生命活动的蛋白质组却仍有40%以上处于功能未知状态，这些"暗物质"蛋白可能与多种疾病发展密切相关。传统单物种蛋白质组学方法难以解析复杂群落中蛋白质的协同规律，而宏蛋白质组学又面临肽段共享性导致的分类学注释困境——就像试图在混纺面料中区分每根纤维的原料来源。

为破解这一难题，由Zhongzhi Sun领衔的研究团队在《npj Biofilms and Microbiomes》发表创新性研究。团队采用RapidAIM体外培养系统，对6名志愿者粪便样本构建的肠道菌群施加107种药物扰动，生成672个质谱样本。通过MaxQuant分析获得肽段定量数据后，创造性地运用肽段丰度相关性网络分析技术，揭示了微生物组响应环境变化的全新规律。

关键技术包括：1）基于RapidAIM平台的体外微生物组药物扰动培养系统；2）LC-MS/MS宏蛋白质组学检测；3）MetaLab V2.3流程进行IGC数据库检索；4）t-SNE算法构建肽段相关性图谱；5）随机森林模型实现基因组水平肽段分类；6）Taxon-normalized peptide abundance(TNPA)标准化方法。

【肽段丰度相关性特征】

研究发现肽段丰度变化呈现显著层级结构：来自同一蛋白质的肽段对Spearman相关系数(SCC)达0.63±0.22，同一基因组不同蛋白的肽段对SCC仍保持0.60±0.22，而不同基因组肽段对的SCC骤降至0.16±0.31。这种差异具有统计学显著性(p≤0.0001)，效应量Vargha和Delaney's A达0.88。有趣的是，功能分类(COG)层面的相关性较弱，暗示微生物群落存在功能冗余补偿机制。

【全局肽段相关性图谱】

通过t-SNE算法将228,178,203对肽段相关性可视化为二维图谱，发现Enterobacteriaceae等菌科的肽段形成特征性簇群。如图2A所示，不同个体的微生物组成呈现明显差异，其中V52个体检测到21,363条肽段，为后续分析提供丰富数据源。

【分类学注释提升】

针对Bacteroidaceae科3,845条仅注释到科水平的肽段，研究团队开发机器学习流程：以基因组特异性肽段为训练集，建立随机森林分类模型。该模型对测试集基因组特异性肽段的分类准确率达95.6%，并将48.9%未注释肽段成功溯源至特定基因组（如MGYG000002281）。如图5所示，模型能有效区分同科不同基因组来源的肽段。

【功能关联网络】

通过TNPA标准化消除物种丰度干扰后，构建的肽段相关性网络展现出显著功能模块性。在Phacaeolartobacterium faecium基因组中，三羧酸循环相关酶MGYG000004769_01826（甲基丙二酰-CoA变位酶）与MGYG000004769_01827（琥珀酰-CoA转移酶）的肽段形成紧密互作簇，二者基因间距仅218bp。类似地，分子伴侣蛋白DnaK与GroEL的肽段也呈现共变特征。

【未知蛋白功能预测】

研究特别关注了蛋白质功能未知(Protein of unknown function, PUF)的肽段连接模式。如图7所示，Bacteroides faecis基因组中未表征蛋白MGYG000002281_00118的肽段与多个己糖胺酶肽段显著相关，结合其预测的胞外结构域，提示该蛋白可能参与碳水化合物代谢的信号传导。

这项研究开创性地将肽段丰度相关性分析引入宏蛋白质组学领域，突破了复杂微生物群落研究的三大瓶颈：1）建立肽段共变特征与分类学归属的定量关系；2）开发基于机器学习的肽段基因组溯源方法；3）通过TNPA标准化揭示物种内部的功能调控网络。尽管当前宏蛋白质组覆盖度限制了对低丰度物种的分析，但随着DIA等技术的发展，该方法有望成为解析微生物"暗物质"功能的新利器。该成果不仅为理解药物-微生物组互作提供新视角，更为精准医疗时代的个体化菌群调控奠定方法论基础。