理性二硫键工程稳定诺如病毒GII.3病毒样颗粒及其在疫苗开发中的应用价值

本研究针对诺如病毒GII.3基因型病毒样颗粒(VLPs)稳定性差的技术瓶颈，通过结构引导的N112C/N189C二硫键工程改造，成功开发出热稳定性提升4.2℃、产量提高2倍的GII.3-DS1 VLPs。该颗粒在冷冻耐受性、免疫原性等方面显著优于野生型，为儿童高发的GII.3诺如病毒疫苗开发提供了优质抗原平台，相关成果发表于《npj Vaccines》。

　　

诺如病毒是全球急性胃肠炎的主要病原体，每年造成约6.8亿病例和21.9万死亡，其中GII基因型占90%的流行疫情。特别值得注意的是，在婴幼儿群体中GII.3和GII.6成为仅次于GII.4的主要流行株。虽然病毒样颗粒(VLPs)作为疫苗候选抗原备受关注，但不同基因型VP1蛋白自组装形成的VLPs存在显著稳定性差异，这严重制约了疫苗研发进程。更棘手的是，GII.3 VLPs存在明显的蛋白酶切割敏感性和结构异质性，导致其在生产储存过程中易发生降解，直接影响疫苗效价评估和免疫效果。

为攻克这一技术难题，Christopher Warren等研究者创新性地将二硫键工程策略从原型GI.1基因型拓展至流行GII基因型。研究团队首先通过AlphaFold2和PyRosetta对GII.3、GII.4和GII.6的VP1蛋白进行三维建模，预测出位于3/5倍对称轴附近的N112-N189残基对可作为二硫键工程靶点。随后构建了DS1突变体(N112C/N189C)，并系统评估了其在哺乳动物细胞表达系统中的组装特性。令人振奋的是，该研究不仅证实了结构引导设计的普适性，更揭示了基因型特异性响应——GII.3-DS1获得显著稳定性提升，而结构相似的GII.6-DS1却未见明显改善。

关键技术方法包括：1) 采用AlphaFold2结合PyRosetta进行VP1蛋白结构预测和能量优化；2) 通过Expi293细胞瞬时表达系统生产野生型和突变体VLPs；3) 运用蔗糖梯度离心结合动态光散射(DLS)评估颗粒均一性；4) 纳米差示扫描荧光法(nanoDSF)定量热稳定性变化；5) 负染电镜(nsEM)直观观察颗粒完整性；6) 建立HBGA阻断实验和单克隆抗体结合实验验证抗原性；7) 采用LNP包裹mRNA进行小鼠免疫原性评价。

研究结果方面：

"Design and expression of disulfide-stabilized GII VLPs"部分显示，结构建模证实GII.3中112-189残基间距最适合二硫键形成，Western blot证实所有构建体在细胞裂解液中均成功表达。

"Engineered GII.3-DS1 and GII.6-DS1 assemble into VLPs"部分通过蔗糖梯度离心证实DS1突变体保持VLP组装能力，其中GII.3-DS1产量较野生型提高2倍。SDS-PAGE显示氧化条件下出现高分子量聚集，证实工程化二硫键形成。

"Disulfide stabilizing mutation enhances VLP formation"部分DLS数据显示GII.3-DS1流体直径从58.34nm降至50.45nm，多分散指数从0.180改善至0.102。nanoDSF检测显示Tm值提升4.2℃，而GII.6-DS1仅提高1℃。

"Electron microscopy"的nsEM图像直观显示，经过冻融循环后GII.3-DS1保持完整颗粒形态，而野生型出现明显降解，2D分类图像证实突变体颗粒均一性显著提升。

"Functional characterization"部分证实GII.3-DS1保持与野生型相当的HBGA结合能力(R²=0.9208)和单抗识别特征(R²=0.8031)，说明结构改造未影响关键抗原表位。

"Immunogenicity studies"最引人注目的发现是，0.5μg剂量的GII.3-DS1 mRNA免疫小鼠产生的HBGA阻断效价比野生型高8倍，这为mRNA疫苗设计提供了重要参考。

这项研究的重要意义在于：首先，首次证实二硫键稳定策略在流行GII.3基因型的适用性，克服了该基因型VLPs稳定性差的技术瓶颈；其次，创建的GII.3-DS1作为优质抗原试剂，可显著提升ELISA和HBGA阻断实验的检测灵敏度；更重要的是，该研究为多基因型诺如病毒疫苗"鸡尾酒"配方的开发奠定了技术基础。特别值得关注的是，研究揭示的基因型特异性稳定化现象提示，未来疫苗设计需要针对不同基因型开展个性化工程改造，这一发现对RNA病毒疫苗研发具有普遍指导价值。