犬胆囊胆管细胞类器官模型的建立及其在胆囊黏液囊肿阴离子通道功能分析中的应用

本研究针对犬胆囊黏液囊肿(GBM)发病机制不明的问题，通过建立健康犬和GBM患犬胆囊胆管细胞类器官(GCOs)模型，首次发现GBM-GCOs呈现芽生型形态特征，并证实其囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)和钙激活氯通道(CaCCs)功能显著受损。该研究为揭示阴离子通道功能障碍与GBM发病的关联提供了新型研究平台，对开发靶向治疗策略具有重要意义。

　　

在宠物临床中，胆囊黏液囊肿(GBM)是困扰犬类健康的常见胆囊疾病，尤其好发于谢德兰牧羊犬、美国可卡犬等特定品种。这种疾病以胆囊内异常黏液蓄积为特征，可引发胆管梗阻甚至胆囊破裂，目前唯一治疗手段是手术切除，但围手术期死亡率高达20%。更棘手的是，GBM的发病机制至今仍是未解之谜。近年研究发现，胆囊上皮细胞中阴离子通道相关分子表达下降可能与GBM发生相关，但受限于缺乏有效的体外研究模型，这一假说始终未能得到验证。

为突破这一研究瓶颈，东京大学农业与生命科学研究科的Itsuma Nagao团队在《The Veterinary Journal》发表重要成果。研究人员创新性地建立了犬胆囊胆管细胞类器官(GCOs)培养体系，分别来自3只健康犬和3只GBM患犬的胆囊组织。通过形态学评估、基因表达分析和功能性器官肿胀实验，重点检测了囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)和钙激活氯通道(CaCCs)的功能差异。关键技术包括：类器官3D培养、免疫细胞化学标记、RT-qPCR基因表达分析，以及基于形态变化的阴离子通道功能评估方法。

形态学评估

正常胆囊来源的GCOs(N-GCOs)主要呈现圆形囊状结构(占比84.3%)，而GBM来源的GCOs(GBM-GCOs)则以芽生型为主(占比84.8%)，表现为管腔狭窄的多腔结构。免疫染色证实两类GCOs均表达上皮细胞标志物EpCAM、胆管细胞标志SOX9、黏蛋白MUC5B等特征性分子，且保持典型的上皮细胞极性。

基因表达分析

RT-qPCR检测显示，两组GCOs在干细胞标记物LGR5、成熟胆管细胞标记TGR5，以及阴离子通道相关基因ANO1、HTR4和CFTR的表达水平均无显著差异，提示形态差异可能源于转录后调控机制。

功能学研究

器官肿胀实验获得突破性发现：

1. 1.

   CFTR功能检测中，Forskolin刺激使N-GCOs面积在2小时内增长至345.5%，而GBM-GCOs仅增至236.3%，且CFTR抑制剂GlyH-101可完全阻断该效应。

2. 2.

   CaCCs功能检测中，ATP刺激下N-GCOs面积增至258.8%，显著高于GBM-GCOs的164.7%，但CaCCs抑制剂CaCCinh-A01对GBM-GCOs的抑制效果不明显。

讨论与意义

该研究首次建立了犬GBM研究的类器官模型，揭示GBM-GCOs存在独特的芽生型形态特征，这种形态改变与人类囊性纤维化患者类器官的表型高度相似。尽管基因表达未见差异，但功能实验证实GBM-GCOs存在CFTR和CaCCs双重功能障碍，这可能是导致黏液"解压缩"过程受阻的关键因素——类似于囊性纤维化中黏液变稠的病理过程。研究创新性地提出GBM可能是一种"局部囊性纤维化样"疾病，其阴离子通道功能障碍更可能源于蛋白定位异常而非基因表达改变。

这一发现为理解GBM发病机制开辟了新视角：阴离子分泌减少→管腔液体不足→黏液浓缩堆积→GBM形成的病理链条。未来利用该模型可深入探究CFTR/ANO1膜转运机制，筛选靶向药物，并为开发替代手术的治疗方案提供理论依据。值得注意的是，研究也存在样本量有限、患犬年龄/品种异质性等局限，后续扩大样本并建立基因编辑类器官将有助于验证因果关系。这项研究不仅为兽医领域提供了首个犬胆囊疾病研究平台，其揭示的离子通道-黏液稳态调控机制对人类胆道疾病研究也具有重要借鉴价值。