"绿藻类囊体内天然Rubisco结构与动态异质性解析：揭示CO2浓缩机制的结构基础"

本研究通过冷冻电子断层扫描技术，首次在单细胞绿藻莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的类囊体(pyrenoid)中原位解析了天然Rubisco（核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶）的三维结构。研究人员采用冷冻聚焦离子束研磨技术制备样品，结合亚断层图像平均分析方法，揭示了Rubisco在CO2浓缩机制中的多构象状态分布特征及其与EPYC1蛋白的动态相互作用，为理解光合碳固定效率提升机制提供了重要结构依据。

　　

光合作用是地球生命赖以生存的基础过程，而Rubisco（核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶）作为这个过程中最关键的酶，却因其缓慢的催化速率和易与O₂发生反应的特性，成为限制碳固定效率的瓶颈。在绿藻等真核生物中，Rubisco被浓缩在类囊体(pyrenoid)这一无膜细胞器中，通过CO₂浓缩机制(CCM)显著提升催化效率。然而，Rubisco在这种高度拥挤的天然环境中的精确结构和动态变化一直是个未解之谜。

为解决这一关键科学问题，由Nadav Elad、Zhen Hou等研究人员组成的国际团队在《Nature Communications》发表了突破性研究成果。研究团队创新性地结合冷冻聚焦离子束(cryo-FIB)研磨技术和冷冻电子断层扫描(cryo-ET)，首次在完整细胞内解析了莱茵衣藻类囊体中天然Rubisco的高分辨率结构，并系统揭示了其结构异质性和动态特征。

关键技术方法包括：1)采用冷冻电子断层扫描技术对冷冻聚焦离子束研磨制备的细胞薄片进行三维成像；2)基于深度学习的颗粒自动识别技术(crYOLO)进行Rubisco颗粒挑选；3)亚断层图像平均分析(STA)结合三维分类方法解析Rubisco多构象状态；4)分子动力学柔性拟合(MDFF)技术将X射线晶体结构适配到冷冻电镜密度图中；5)差异密度图分析揭示局部构象变化。

研究结果部分：

"Structural heterogeneity of pyrenoid Rubisco is revealed by the classification of sub-volumes"

通过亚体积分类分析，研究人员发现类囊体中的Rubisco存在显著的结构异质性。从148,639个颗粒中鉴定出20个结构类别，其中最佳解析的类别（class 12）达到8.1?分辨率，占总颗粒数的12%。这种异质性主要来源于活性位点局部构象变化和大亚基二聚体界面结合蛋白的差异。

"The best-resolved Rubisco complex is in a closed conformation state"

最高分辨率的Rubisco结构显示其处于闭合构象状态。通过分子动力学柔性拟合将X射线结构(PDB 1GK8)适配到冷冻电镜图中，发现活性位点关键区域（包括loop 6、N端和C端）与闭合构象晶体结构高度一致，RMSD仅为2.75?。特别值得注意的是，C端Asp473与R134、H310形成的"门闩"相互作用在天然环境中得以保持，这对维持催化效率至关重要。

"Local conformational changes and binding proteins are the main sources of heterogeneity"

差异密度图分析揭示了Rubisco活性位点区域存在显著构象变化。当从其他类别（classes 7,10,13）减去class 12时，在活性位点观察到明显的正密度差异，表明天然Rubisco群体存在多种活性状态。此外，在大亚基二聚体界面附近发现可能与未知结合蛋白相互作用的额外密度，这与α-和β-羧酶体中观察到的Rubisco结合模式相似但又不完全相同。

"Asymmetric binding to Rubisco"

非对称性分析显示，EPYC1（Essential Pyrenoid Component 1）蛋白以部分占据的方式结合在Rubisco小亚基表面。这种结合模式在施加D4对称性时被平均掉，说明EPYC1并非同时结合所有小亚基，而是动态地与Rubisco相互作用，这与类囊体通过液-液相分离(LLPS)机制形成的特点相符。

"Distribution of Rubisco in the pyrenoid"

空间分布分析表明Rubisco在类囊体中的排列总体上是随机的，平均相邻颗粒间距约13nm。然而，在严格的距离和角度限制下可识别出局部簇状结构，包括纤维状和螺旋状排列。有趣的是，不同结构类别的Rubisco在CO₂富集区（距类囊体微管200nm内）的分布存在差异，class 12等高分辩率类别在CO₂富集区丰度较低，暗示构象状态可能与微环境相关。

这项研究首次在原生环境中揭示了Rubisco的结构动态特性和组织原则，为理解CO₂浓缩机制的结构基础提供了重要见解。研究发现类囊体Rubisco存在多种构象状态，包括闭合的活性构象，这种构象异质性与羧酶体中观察到的刚性包装模式形成鲜明对比。EPYC1蛋白的不对称结合和Rubisco的随机分布特征支持了类囊体通过液-液相分离机制动态组装的假说。

这些发现不仅深化了对天然光合作用机制的理解，也为人工改造作物碳固定途径提供了重要线索。特别是Rubisco活性位点构象变化与CO₂微环境的相关性，以及大亚基二聚体界面潜在的新结合蛋白的发现，为设计更高效的碳固定系统指明了新方向。该研究建立的技术框架也为未来在更高分辨率下研究其他天然蛋白质复合物的结构和功能关系提供了范例。