靶向MBNL1启动子的小RNA双链体通过RNA激活机制缓解强直性肌营养不良相关剪接缺陷

本研究针对强直性肌营养不良(DM)中Muscleblind-like蛋白(MBNL)功能缺失导致的剪接缺陷，设计靶向MBNL1启动子的小激活RNA(saRNA)，首次证实RNA激活(RNAa)机制可通过AGO2介导的转录调控增强内源性MBNL1表达，显著纠正DM相关剪接异常。该研究为DM治疗提供了新型RNA靶向策略，发表于《Nucleic Acids Research》。

　　

强直性肌营养不良1型(DM1)是一种由DMPK基因中CUG重复扩增(CUG^exp)引起的多系统疾病，其核心病理机制是肌肉盲样蛋白(Muscleblind-like, MBNL)家族被异常RNA foci捕获导致功能缺失。作为RNA剪接调控的关键因子，MBNL蛋白的耗竭会引发数百个前体mRNA的异常剪接(AltS)，使成年组织重现胚胎剪接模式，最终导致肌肉强直、萎缩和多器官功能障碍。目前DM治疗主要针对症状缓解，尚无有效根治手段。虽然通过AAV载体过表达MBNL1能在动物模型中改善症状，但存在剂量难以控制、组织纤维化等副作用风险。因此，开发能精确调控内源性MBNL1表达的治疗策略成为研究热点。

波兰波兹南生命科学大学Ewa St?pniak-Konieczna团队在《Nucleic Acids Research》发表的研究中，创新性地利用RNA激活(RNA activation, RNAa)机制，设计靶向MBNL1启动子的小激活RNA(small activating RNA, saRNA)双链体，成功实现内源性MBNL1转录增强并纠正DM相关剪接缺陷。

研究采用的主要技术包括：1) 生物信息学指导的saRNA设计靶向MBNL1启动子区域；2) DM1患者来源的原代成纤维细胞和肌母细胞模型；3) CUT&RUN染色质分析技术检测RNA聚合酶II(RNAPII)和AGO2的启动子结合；4) 新生RNA捕获实验验证转录激活；5) 双荧光素酶报告系统评估启动子活性；6) 免疫荧光和RNA-FISH分析MBNL1蛋白定位与RNA foci。

saRNA双链体靶向MBNL1基因启动子可提高转录水平

研究人员针对MBNL1主要活性启动子P2设计19组saRNA，在DM1成纤维细胞中筛选出两个高效双链体saMB1_1和saMB1_2，能使MBNL1 pre-mRNA和mRNA水平提升2-3倍。剂量效应实验显示75 nM为最佳浓度，且该效应具有序列特异性——种子区突变或序列打乱的对照均无效。值得注意的是，同时转染两个saRNA会相互抑制，CUT&RUN分析揭示这是由于邻近位点的空间位阻阻碍了转录复合体形成。

saRNA通过转录起始和延伸增强MBNL1表达

新生RNA捕获实验证实saRNA处理组新合成MBNL1 RNA显著增加，而actinomycin D处理显示mRNA稳定性未改变，表明调控发生在转录层面。CUT&RUN扫描发现saRNA能特异性招募AGO2和RNAPII至靶位点：RNAPII Ser5P(起始形式)在转录起始位点(TSS)附近富集，而RNAPII Ser2P(延伸形式)沿基因体分布，证实了完整的转录激活过程。机制研究表明，RNAa核心组分AGO2、RNA解旋酶A(RHA)和PAF1复合体成员CTR9的敲除均能阻断saRNA效应。

MEIS转录因子参与saMB1_1的特异性激活

生物信息学分析发现saMB1_1靶序列与MEIS1/2转录因子结合位点重叠。实验证实敲低MEIS1/2会选择性抑制saMB1_1介导的MBNL1上调，而saMB1_2不受影响，CUT&RUN进一步验证MEIS2仅被saMB1_1招募至启动子。这表明不同saRNA可能通过募集特异转录因子实现调控多样性。

反义链引导的RNA:DNA杂交模型

通过5'端生物素化(5'BIO)和错配(MM)修饰实验，证实反义链(AS)是AGO2加载的功能链——抑制AS完全阻断RNAa，而促进AS选择则增强效应。双荧光素酶报告系统显示，删除saMB1_2靶序列会消除启动子激活，证实了其与基因组DNA的直接相互作用。相反，尽管MBNL1-AS1长链非编码RNA与P2区域重叠，但RNAi和GapmeR介导的敲除实验证明其不参与RNAa机制。

MBNL1蛋白增加与剪接纠正

Western blot和免疫荧光显示saRNA处理120小时后MBNL1蛋白水平提升1.3-3倍，且不影响核内CUG^exp foci数量。剪接分析显示多个DM1生物标志外显子呈现剂量依赖性校正：MBNL1负调控外显子(如MBNL1 e5、NFIX e7)包含率降低，而正调控外显子(如INSR e11、FLNB e31)包含率增加，部分外显子纠正幅度达100%。

这项研究首次证实靶向内源性启动子的RNAa策略可安全有效地缓解DM1剪接病理。相较于过表达方法，该技术具有三大优势：(1) 通过P2启动子的自调控机制避免蛋白过量积累；(2) 产生天然异构体组合；(3) 位点特异性作用减少脱靶效应。研究还揭示了MEIS等新型MBNL1调控因子，为理解其转录调控网络提供新视角。未来研究需优化saRNA递送效率，特别是在肌肉组织中的靶向性，并探索与其他MBNL家族成员的协同治疗潜力。该成果不仅为DM治疗开辟了新途径，也为其他RNA介导疾病的表观遗传调控提供了范式参考。