RNA聚合酶I转录终止的分子机制：核糖体RNA前体保守发夹结构的关键作用

本研究揭示了真核生物RNA聚合酶I（Pol I）转录终止的核心机制。针对长期以来关于Pol I终止路径的争议，研究人员通过体外重构实验证明：核糖体RNA前体（pre-rRNA）保守发夹结构是高效终止的关键元件，其与阻滞蛋白（Reb1/Nsi1）和T-rich序列协同作用，促使Pol I深度回溯并失活切割活性，最终实现生理速率下的转录终止。该发现统一了既往矛盾模型，为理解真核生物核糖体RNA合成调控提供了新范式。

　　

在真核细胞中，核糖体RNA前体（pre-rRNA）的合成占据了全部RNA产量的80%以上，这一过程由RNA聚合酶I（Pol I）完成。然而令人惊讶的是，尽管研究已持续数十年，科学界对Pol I如何终止转录这一基本问题仍存在激烈争议。早期研究提出了多种相互矛盾的模型：有的认为阻滞蛋白（如酵母中的Reb1或Nsi1）的物理碰撞足以引发终止；有的强调T-rich序列的核心作用；还有"鱼雷"模型主张需要反式作用因子切割新生RNA。这些分歧很大程度上源于不同实验体系中未充分考虑pre-rRNA自身的结构特征。

为破解这一谜题，研究人员在《SCIENCE ADVANCES》发表的研究中，通过精妙的体外转录系统重构实验，首次证实pre-rRNA的保守发夹结构是Pol I高效终止的核心元件。研究采用纯化的酿酒酵母蛋白质体系，构建了包含不同DNA模板的转录延伸复合物（EC），通过放射性标记、核酸酶足迹分析等技术，系统考察了阻滞蛋白、T-rich序列和RNA发夹的协同作用机制。

主要技术方法

研究团队纯化了酿酒酵母的Pol I全酶及阻滞蛋白Reb1/Nsi1，通过体外组装EC（延伸复合物）模拟终止过程。关键实验包括：利用α-[³²P]GTP标记RNA3'端监测转录产物；Exo III（核酸外切酶III）足迹分析确定Pol I回溯位置；设计含AP位点（无碱基位点）的模板评估阻滞蛋白特异性；突变T-rich序列验证其功能；时间分辨实验测定终止动力学参数。

Pol I termination is caused by pre-RNA hairpin

研究发现，仅靠Reb1/Nsi1阻滞或T-rich序列均不能实现高效终止（<1% RNA释放）。但当引入pre-rRNA发夹的16bp基部序列时，终止效率在20秒内跃升至80%以上。值得注意的是，随机设计的9bp发夹同样有效，说明发夹稳定性而非特定序列是关键。这一发现解释了既往矛盾结果——那些"仅靠阻滞蛋白"或"仅靠T-rich序列"就能终止的实验，其实验模板中意外保留了能形成RNA二级结构的序列。

Pol I backtracks toward termination RNA hairpin

Exo III足迹实验揭示，被阻滞的Pol I会从碰撞点深度回溯约20bp，这一过程伴随Rpa12亚基介导的RNA切割活性关闭。这种"自我失活"机制确保Pol I不会通过切割回溯RNA自救，而是被迫走向终止。当人为缩短发夹与阻滞位点距离至8bp时，即使不使用天然阻滞蛋白，仅靠AP位点阻滞也能实现高效终止，证明回溯距离是限速因素。

Native roadblock and T-rich sequence are required for efficient backtracking

T-rich序列的双重功能被阐明：其弱化RNA/DNA杂交体的特性促进EC解离，同时与阻滞蛋白协同引发快速回溯。突变实验显示，破坏T-rich序列的嘧啶连续性或增强杂交体稳定性都会显著降低终止效率。特别有趣的是，哺乳动物研究中认为必需的PTRF释放因子，可能只是因为实验设计中去除了天然发夹结构才显得必要。

Deep backtracking inactivates Pol I RNA hydrolytic activity

时间分辨切割实验显示，正常延伸的Pol I能快速（<10秒）切割回溯RNA，但深度回溯至T-rich序列后，切割活性下降百倍以上。这种"不可逆回溯"的分子开关效应，确保EC一旦进入终止程序就不会中途逆转。

讨论与意义

该研究提出的统一模型完美解释了领域内数十年的争议：pre-rRNA发夹是终止的"执行者"，而阻滞蛋白和T-rich序列共同构成"质量控制开关"——前者确保只有正确位置的EC才会终止，后者则防止pre-rRNA基因内部发夹引发早熟终止。这种机制在酵母、爪蟾、小鼠和人类中高度保守，暗示其是真核生物维持rRNA稳态的核心策略。

研究还澄清了"鱼雷"模型和PTRF因子的生物学意义：它们可能是应对Pol I"交通堵塞"的备用机制。当多个Pol I排队导致前沿EC无法正常回溯时，RNase（如酵母Rnt1）切割滞留RNA的"鱼雷"机制才被激活。这解释了为什么这些因子在敲除实验中显示非必需性。

这项突破性工作不仅解决了转录领域的基础科学问题，更为靶向Pol I的抗癌药物设计提供了新思路——人工发夹结构或可被开发为特异性阻断rRNA合成的分子工具。同时，研究中建立的体外重构体系为解析其他RNA聚合酶的终止机制提供了范式。