微生物群落的演替会改变活性成分，并影响仿野生条件下栽培的Anoectochilus roxburghii植物的品质

《Industrial Crops and Products》：Microbiota succession drives changes in active ingredients and alters the quality of Anoectochilus roxburghii during wild-imitated cultivation

本研究通过分析野生模拟栽培下石斛（Anoectochilus roxburghii）的微生物群落动态，发现细菌多样性显著增加（Chao1指数从690.46增至889.10），真菌多样性则呈下降趋势，核心菌群如Methylobacterium-Methylorubrum和Gyoerffyella与皂苷、黄酮类等活性成分的积累呈正相关。代谢通路分析表明，黄酮类、酚类及多糖合成相关通路在栽培后期显著增强，且野生模拟栽培的活性成分含量显著高于组织培养。研究为构建合成微生物群落（Syncom）优化石斛栽培提供了理论基础。

　　本研究聚焦于一种传统中药材——Anoectochilus roxburghii（罗汉果），探讨其在模拟野生环境下的培养过程中，微生物群落与活性成分之间的动态变化及其相互作用机制。罗汉果不仅在饮食中被广泛使用，还具有显著的药用价值，常用于治疗糖尿病、关节炎和肝炎等疾病。其主要活性成分包括黄酮类化合物、多酚类物质、多糖和金丝桃苷。这些成分不仅影响其药效，还决定了其在不同环境下的营养价值和临床效果。然而，由于野生资源的过度采集，导致其自然分布受到严重威胁，同时人工栽培的品质不稳定，活性成分含量较低。因此，研究其微生物群落如何影响活性成分的积累，对于提高罗汉果的药用价值和种植质量具有重要意义。

在本研究中，我们采集了模拟野生环境（WC）和组织培养（TC）条件下不同培养时间点的罗汉果样本，并对其微生物群落和活性成分进行了系统分析。结果显示，随着培养时间的延长，细菌的多样性指标如Chao1指数和Shannon指数显著上升，表明微生物群落的结构和组成在不同阶段发生了明显变化。具体而言，细菌的Chao1指数从初始阶段的690.46上升至培养四个月后的889.10，而Shannon指数也从3.68增加到4.34。网络复杂度从7.43增加到33.71，显示出微生物之间的互动关系变得更加紧密和多样化。相比之下，真菌的多样性变化趋势则与细菌相反，其Shannon指数和Chao1指数在培养初期有所下降，之后趋于稳定。这可能与细菌和真菌在植物体内竞争资源有关，随着细菌的富集，真菌的生长可能受到抑制。

通过分类分析，我们发现不同培养阶段的内生微生物群落组成存在显著差异。在最初的种植阶段（5月17日），内生细菌主要由分枝杆菌科和草酸杆菌科构成，占比分别为31.71%和37.94%。然而，随着培养时间的推移，这些菌群的比例逐渐减少，而假单胞菌科和碱杆菌科的比例则显著上升。在培养一个月后，内生细菌以肠杆菌科为主导，占比达21.56%。随着培养时间的延长，肠杆菌科的丰度持续增加，最终成为主导菌群。而对于真菌，其主导菌群在培养三月后由枝孢霉科和毛霉科转变为镰刀菌科、座囊菌目和角担菌科，显示出其在不同生长阶段对环境适应性的变化。

进一步的共现网络分析揭示了微生物群落的结构变化及其对活性成分积累的影响。结果显示，细菌的共现网络复杂度从5月的7.43增加到8月的33.71，表明细菌之间的相互作用逐渐增强。同时，细菌间正相关比例也从86.09%上升至90.11%，说明微生物之间的合作趋势更加明显。相反，真菌的共现网络复杂度在6月达到峰值，随后逐渐下降。真菌之间的正相关比例从99.81%增加到99.90%，表明其内部合作关系在培养过程中逐渐稳定。值得注意的是，细菌和真菌在培养初期表现出较强的互动性，但随着植物的成熟，这种互动逐渐转向竞争关系。

在微生物来源追踪方面，FEAST分析表明，罗汉果的内生微生物主要来源于相邻的植物组织，如茎、叶和根。例如，在5月，有55.19%的茎部细菌来源于根部，而在8月这一比例下降至35.51%。这说明微生物的分布具有一定的组织特异性，且受到植物生长过程中相邻组织的微环境影响。此外，植物在移植到模拟野生环境后，其根部和叶片可能分泌某些物质，以吸引新的微生物群落，这些微生物随后可能通过根部和叶片传播至茎部。这种动态变化过程反映了微生物在植物生长过程中的适应性和迁移能力。

在核心微生物群的鉴定中，我们识别出20种核心细菌属和23种核心真菌属。这些核心微生物在不同培养阶段均显示出与活性成分的正相关性，可能在促进活性成分积累方面发挥关键作用。例如，Methylobacterium-Methylorubrum和Gyoerffyella被发现与金丝桃苷、总黄酮和总多酚含量呈正相关，而Curtobacterium和Apiotrichum则与总多糖含量相关。这些核心微生物可能通过激活特定的代谢通路，如黄酮类和多酚类生物合成途径，以及脂多糖合成途径，促进活性成分的积累。此外，部分核心微生物可能通过提供前体物质或促进代谢过程，间接影响罗汉果的药效和营养价值。

进一步的功能预测分析表明，核心微生物的代谢功能在不同培养阶段发生了显著变化。在模拟野生环境下，与总黄酮相关的代谢通路如黄酮和黄酮醇生物合成、黄酮类生物合成等在5月至6月期间被显著富集，而在组织培养过程中这些通路未被激活。这可能意味着模拟野生环境下的微生物群落更有利于黄酮类物质的合成。对于总多酚，其相关的代谢通路如苯丙烷类生物合成、 stilbenoid、 diarylheptanoid和 gingerol生物合成在5月至6月期间被富集，而组织培养条件下则未见类似现象。这些结果表明，模拟野生环境下的微生物可能通过促进这些代谢通路的活性，显著提高罗汉果中总多酚的含量。至于总多糖，其相关代谢通路如脂多糖生物合成在组织培养条件下被富集，而在模拟野生环境下未见明显变化。这可能表明在组织培养过程中，微生物对多糖合成的贡献更大，而在模拟野生环境下，其影响相对较小。

在金丝桃苷的代谢通路方面，研究推测其可能与丁酸代谢相关。金丝桃苷的苷元是丁内酯，而丁酸可以转化为丁内酯，进而与葡萄糖结合形成金丝桃苷。然而，由于金丝桃苷的代谢通路尚未完全阐明，因此这一推测仍需进一步实验验证。此外，研究还发现，在模拟野生环境下，真菌的丰度逐渐增加，而在组织培养条件下则逐渐减少。这可能意味着模拟野生环境下的真菌群落对植物活性成分的积累更具促进作用。例如，某些真菌可能通过提供前体物质或调节代谢途径，帮助植物合成更多的活性成分。

本研究还探索了合成微生物群（Syncom）的构建可能性，以进一步验证核心微生物对罗汉果活性成分积累的影响。我们筛选出20种核心细菌属和23种核心真菌属作为Syncom的潜在构建对象。这些微生物可能通过激活特定的代谢通路，提高罗汉果中活性成分的含量。例如，1174–901–12和Methylobacterium-Methylorubrum可能通过促进黄酮类和多酚类物质的合成，提高其含量。而Gyoerffyella则可能通过提供某些化合物，如（R）-3-乙酰基-5,7-二甲氧基-3H-异苯并呋喃-1-酮等，间接促进活性成分的积累。然而，这些微生物尚未经过分离和功能验证，因此其具体作用仍需进一步研究。

此外，研究还发现，某些核心微生物可能通过促进植物生长和增强抗逆性，间接影响活性成分的积累。例如，1174–901–12和Methylobacterium-Methylorubrum可能通过固氮作用促进植物生长，从而间接提高活性成分的含量。而Chitinibacteraceae和Paracaedibacteraceae可能通过分解几丁质，促进有机物的循环利用，进而影响活性成分的合成。这些核心微生物在植物生长过程中可能扮演重要角色，其功能仍需通过实验进一步验证。

综上所述，本研究揭示了罗汉果在模拟野生培养过程中，微生物群落与活性成分之间的复杂关系。随着培养时间的延长，微生物群落的结构和功能发生变化，这些变化可能通过调节代谢通路和促进物质合成，提高罗汉果的药用价值和营养价值。同时，研究还指出，某些核心微生物可能具有特定的功能，如促进黄酮类、多酚类和多糖类物质的合成，从而成为未来构建Syncom的重要候选。这些发现不仅为理解植物-微生物互作机制提供了新的视角，也为提高罗汉果的质量和可持续利用提供了科学依据。然而，由于当前研究基于预测分析，未进行实际分离和功能验证，因此后续实验仍需进一步确认这些微生物的具体作用机制。