基于FRET技术解析人类β-心脏肌球蛋白IHM结构状态及其在心肌病突变中的调控机制

这篇研究开发了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的创新检测方法，首次实现了对人类β-心脏肌球蛋白（β-cardiac myosin）相互作用头基基序（IHM）中阻断头构象（BHC）的溶液态直接定量。通过该传感器揭示了S2尾部通过带正电的loop2与Ring2簇静电相互作用形成preBHC中间态的关键机制，并证实肥厚型心肌病（HCM）突变P710R会破坏BHC稳定性，而扩张型心肌病（DCM）突变E525K则增强该状态。该技术为研究心肌病致病突变对肌球蛋白结构态的影响提供了直接工具。

　　

研究背景与意义

心脏收缩功能的核心在于肌球蛋白分子在ATP酶循环中经历的多重结构状态转换，其中处于"关闭状态"（OFF-state）的肌球蛋白通过相互作用头基基序（IHM）将催化头折叠成特殊构象以节省能量。这一状态的稳定性与多种心肌病密切相关——肥厚型心肌病（HCM）突变往往破坏IHM，而扩张型心肌病（DCM）突变则可能稳定该状态。然而，现有检测方法如单核苷酸周转实验（SRX）仅能间接反映生化状态，缺乏对IHM结构变化的直接监测手段。

FRET传感器的创新设计

研究团队基于人类β-心脏肌球蛋白IHM的高分辨率结构（PDB 8ACT），巧妙设计了一种双荧光标记系统：将供体荧光团AF488标记在调节轻链（RLC）C端，受体Cy3-ATP结合于核苷酸结合口袋。该设计利用BHC构象中RLC与ATP结合位点距离（约7 nm）显著短于开放构象（约9 nm）的特性，通过FRET效率变化实现对BHC状态的直接监测。15-hep HMM（含15个七肽重复的S2尾部）构建体可形成IHM，而8-hep构建体则不能，这为验证传感器特异性提供了理想对照。

盐浓度与突变效应的结构验证

通过稳态和时间分辨FRET实验发现，增加钾离子浓度（0-150 mM KOAc）会显著降低FRET效率，这与SRX检测显示的OFF-state比例下降高度一致。更重要的是，该传感器成功捕捉到心肌病突变的结构效应：HCM突变P710R使FRET效率降低7%，而DCM突变E525K则提高3%，这与二者分别破坏和稳定IHM的病理机制完美吻合。通过双距离分布模型分析，确认溶液中存在3.8-4.5 nm（BHC）和7.9-8.9 nm（开放态）两种主导构象。

动力学揭示的BHC形成机制

停流实验揭示了ATP结合后BHC形成的动态过程：在15-hep HMM低盐条件下观察到11 s^-1（快相）和1.1 s^-1（慢相）双相动力学，分别对应BHC形成和游离头的恢复行程转变。使用不可水解的Cy3-ATP-γ-S仍能检测到8 s^-1的FRET变化，证实BHC形成可发生于ATP水解之前。特别值得注意的是，S2尾部通过带正电的loop2与Ring2簇（E924-E935）形成preBHC中间态，这一关键步骤解释了为何多数HCM突变集中于该负电氨基酸簇。

对心肌调控理论的革新认识

研究提出了全新的BHC形成级联反应模型：ATP结合后，肌球蛋白头部首先从后行程态（poststroke）转变为前行程态（prestroke），此时loop2与S2尾部Ring2发生初始静电相互作用形成preBHC；随后通过mesa结构域与Ring1的更强结合，最终形成具有夸张转角特征的BHC。这种"两步走"机制完美解释了为何缩短S2尾部或破坏静电相互作用都会阻碍OFF-state形成。该发现为理解心肌收缩调控提供了结构动力学基础，并为开发靶向IHM状态的心肌病治疗药物指明了新方向。