基于LexA-E. coli双杂交系统解析GRP78与cl-Par-4肿瘤抑制蛋白的磷酸化非依赖性相互作用

这篇研究创新性地将LexA-E. coli双杂交系统（LexA-E2H）应用于人类蛋白质互作研究，首次直接验证了内质网伴侣蛋白GRP78与剪切型前列腺凋亡反应蛋白4（cl-Par-4）的磷酸化非依赖性结合。通过MacConkey琼脂显色筛选和β-半乳糖苷酶定量分析，该技术为资源有限的实验室提供了规避真核细胞培养干扰的高效研究方案，为肿瘤靶向治疗机制探索提供了新工具。

　　

Abstract

LexA-E. coli双杂交系统（LexA-E2H）作为微生物蛋白互作研究的经典工具，本研究首次将其拓展至哺乳动物蛋白互作领域。通过改造的SU202大肠杆菌报告菌株和携带野生型/突变型LexA DNA结合域（DBD）的载体系统，研究人员建立了无需真核培养环境的人类蛋白互作检测平台。该系统利用染色体整合的lacZ报告基因和杂合LexA操作子（op408/op+），通过抑制β-半乳糖苷酶表达来特异性检测异源二聚体相互作用。

MULTIDISCIPLINARY ABSTRACT

这项技术突破的核心价值在于：①采用MacConkey琼脂显色法实现直观的菌落初筛（红色为阴性，浅白粉色为阳性）；②通过β-半乳糖苷酶酶活测定进行定量验证；③规避了真核细胞培养的复杂性。研究团队以葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和剪切型前列腺凋亡反应蛋白4（cl-Par-4）为模型，揭示了该技术在肿瘤相关蛋白互作研究中的独特优势。

1. Introduction

传统蛋白互作研究方法如酵母双杂交（Y2H）和免疫共沉淀-质谱联用（coIP/MS）存在成本高、技术要求严苛等局限。LexA-E2H系统通过改造的转录抑制机制：将目标蛋白分别与野生型（wt-DBD）和突变型（mut-DBD）LexA片段融合，当两者互作时可形成功能性二聚体结合于杂合操作子，抑制lacZ表达。该系统采用单拷贝染色体整合报告基因，避免了质粒拷贝数变异带来的误差。

2. Materials and methods

2.1 载体构建

GRP78被克隆至pSR658载体形成wt-DBD-GRP78融合蛋白，cl-Par-4（132-340残基）则同时构建于pSR658/pSR659载体。Western blot验证显示：

• •

  40 kDa条带对应mut-DBD-cl-Par-4（10 kDa LexA+24 kDa cl-Par-4）

• •

  90 kDa条带对应wt-DBD-GRP78（88 kDa）

2.2 互作检测

采用含乳糖的MacConkey琼脂进行显色筛选：

• •

  阴性对照（如CAT/cl-Par4）呈深红色

• •

  阳性对照（如VapB-1/VapC-1）呈浅白粉色

• •

  GRP78/cl-Par-4测试组显示特征性浅粉色

2.3 定量分析

β-半乳糖苷酶测定显示：

• •

  GRP78/cl-Par-4互作产生434±41 Miller单位

• •

  cl-Par-4同源二聚体为394±139 Miller单位

• •

  阴性对照高达1029-1760 Miller单位

3. Results and discussion

3.1 技术优势

LexA-E2H的抑制型报告系统相比激活型Y2H具有更低背景噪音：

• •

  采用阻遏蛋白避免自激活假阳性

• •

  大肠杆菌环境排除了真核同源蛋白干扰

• •

  可检测部分对酵母有毒性的蛋白

3.2 生物学意义

cl-Par-4含有的SAC结构域（137-195残基）和C端卷曲螺旋（265-340残基）在凋亡中起关键作用。研究发现：

• •

  GRP78/cl-Par-4互作不依赖磷酸化修饰

• •

  该互作强度与cl-Par-4同源二聚体相当

• •

  为开发靶向GRP78-cl-Par4通路的抗肿瘤策略提供新依据

4. Conclusion

本研究首次实证了LexA-E2H系统在人类蛋白互作研究中的适用性，揭示了GRP78与cl-Par-4的固有结合特性。该技术为：

① 教学实验室提供低成本研究工具

② 大规模互作筛查建立前期验证平台

③ 蛋白结合域定位研究提供新方法

5. Future perspectives

未来发展方向包括：

• •

  开发荧光报告系统提升检测灵敏度

• •

  结合结构生物学解析互作界面

• •

  拓展至膜蛋白互作研究领域

• •

  用于小分子互作抑制剂的初筛