锁核酸修饰反义寡核苷酸通过靶向抑制CTGF减轻瘢痕增生的机制研究

这篇研究创新性地设计了靶向结缔组织生长因子(CTGF)第5外显子的锁核酸(LNA)和2′-O-甲氧乙基(MOE)修饰反义寡核苷酸(ASO)，通过体外实验证实LNA-ASO#1能显著抑制成纤维细胞增殖和ECM蛋白表达，并在小鼠/兔瘢痕模型及裸鼠瘢痕疙瘩异种移植模型中验证其通过抑制TGF-β1/Smad和PI3K/AKT/ERK通路降低IL-6表达、改善胶原沉积的作用，为瘢痕治疗提供了新型靶向策略。

　　

引言

瘢痕形成是皮肤损伤后的复杂生理反应，涉及巨噬细胞等炎症细胞释放细胞因子激活成纤维细胞。虽然炎症对初期愈合至关重要，但过度活化的成纤维细胞和细胞外基质(ECM)沉积（尤其是I/III型胶原）会导致病理性瘢痕。转化生长因子-β1(TGF-β1)信号通路虽在纤维化中起核心作用，但直接靶向该通路的药物研发受限。结缔组织生长因子(CTGF)作为TGF-β1下游效应分子，通过增强TGF-β1受体相互作用加剧纤维化。值得注意的是，CTGF第5外显子编码的CT结构域在调控细胞粘附、迁移及ECM合成中起关键作用，且动物实验显示删除该外显子不会引起TGF-β1敲除导致的广泛炎症，使其成为更具选择性的干预靶点。

材料与方法

研究团队从NCBI数据库获取CTGF第5外显子序列，采用Gamper设计法合成11种含MOE、LNA和硫代磷酸酯(PS)骨架修饰的反义寡核苷酸(ASO)。通过小鼠/兔耳瘢痕模型及裸鼠瘢痕疙瘩异种移植模型，采用10 μL剂量（0.5 mg/kg）每周两次局部注射。体外实验采用CCK-8、EdU检测细胞活力，Western blot分析CTGF、Col-1α、Col-3α等蛋白表达，qPCR检测mRNA水平，并利用免疫荧光和Masson染色观察组织形态。

结果

ASO筛选与修饰优化

免疫荧光证实人病理性瘢痕中CTGF显著高表达。在11种ASO中，ASO#1对小鼠原代皮肤成纤维细胞(PSF)的CTGF抑制IC₅₀为50 nM，且48小时作用达峰值。MOE/LNA修饰显著提升ASO稳定性——FAM标记显示修饰后ASO在细胞内留存时间延长至7天（未修饰组仅5天）。LNA-ASO#1在同等摩尔浓度下对Col-1α/Col-3α mRNA的抑制效果优于MOE-ASO#1，并能更强效阻断Smad2/3、PI3K/AKT和ERK磷酸化。

动物模型验证

在兔耳瘢痕模型中，LNA-ASO#1治疗组瘢痕隆起指数(SEI)降低，HE染色显示真皮厚度减少50%，羟脯氨酸含量下降35%。小鼠模型中新毛发再生，且α-SMA表达量较模型组降低2.1倍。裸鼠移植实验表明，LNA-ASO#1使瘢痕疙瘩重量减少42%，并通过抑制TGF-β1/Smad通路使p-Smad2/3水平降低60%。

分子机制

ASO处理显著下调IL-6表达（兔耳模型降低58%），并呈剂量依赖性减少CTGF、Fn等ECM成分。划痕实验显示LNA-ASO#1使瘢痕成纤维细胞(KF)迁移率下降72%，Western blot证实其对PI3K/p-AKT通路的抑制效率比MOE-ASO#1高1.8倍。

讨论

该研究突破性地证明LNA修饰可增强ASO与靶mRNA的结合特异性，其抑制瘢痕效果优于MOE修饰。通过双重阻断Smad依赖和非依赖通路，CTGF-ASO实现了对纤维化进程的多靶点调控。值得注意的是，LNA-ASO#1在动物模型中展现的促毛囊再生作用，提示其可能通过微环境重塑促进组织正常化。但需进一步评估长期毒理和药代动力学(PK)参数，以推动其向肺纤维化等适应症拓展。

意义陈述

本研究设计的LNA-ASO#1通过精准靶向CTGF第5外显子，为病理性瘢痕提供了兼具高效性和特异性的治疗新策略，其创新性的核酸修饰方案为纤维化疾病药物研发开辟了新路径。