一种含有香草醛–吡啶–咪唑核心结构的荧光探针，用于检测巨噬细胞在骨稳态过程中的极化情况，以识别羧酸酯酶的活性

《Frontiers in Chemistry》：A fluorescent probe with a vanillin–pyridine–imidazole core structure for carboxylesterase detection in macrophage polarization during bone homeostasis

荧光探针VanPI-CarE基于vanillin-pyridine-imidazole核心结构，通过检测羧酯酶（CarE）活性实现骨稳态中巨噬细胞极化的可视化。溶液测试显示其具有高灵敏度（量子产率0.15）、选择性（抑制其他竞争酶）、稳定性（pH 7.0-9.0，35-40℃）及低细胞毒性（>90%细胞存活率）。共聚焦成像证实该探针可实时监测巨噬细胞分化（M1/M2极化）与骨代谢调控（如ox-LDL和RANKL刺激），为炎症相关疾病研究提供新工具。

　　本研究中，科学家们开发了一种新型的荧光探针VanPI-CarE，用于检测巨噬细胞极化过程中与骨稳态相关的羧酯酶（CarE）。这种探针的核心结构由香草醛、吡啶和咪唑组成，能够通过特定的荧光响应机制，对CarE进行高灵敏度、高选择性和低细胞毒性的检测。研究团队通过一系列实验验证了该探针在溶液系统和活细胞成像中的性能，并发现其能够反映骨稳态中巨噬细胞极化状态的变化，无论是诱导还是抑制条件下的变化。这些成果为炎症相关研究提供了新的工具和视角。

骨稳态是维持骨骼组织生成、修复和重建的关键过程，它涉及骨形成与吸收之间的动态平衡。在这个过程中，巨噬细胞的极化是一个重要的调控环节。巨噬细胞可以分化为具有不同功能的两种类型：M1型巨噬细胞通常与促炎反应相关，而M2型巨噬细胞则主要参与抗炎和组织修复。M1型巨噬细胞在炎症反应中发挥重要作用，它们不仅能够呈现抗原，还分泌促炎细胞因子，进而影响骨吸收。相比之下，M2型巨噬细胞则通过促进组织修复和矿化，帮助骨形成。近年来，研究发现巨噬细胞极化与脂质代谢密切相关，其中氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）作为关键因子，能够通过影响Toll样受体（TLRs）和清道夫受体，激活巨噬细胞向M1型极化，而饱和脂肪酸则通过NF-κB信号通路诱导M1型极化，而不饱和脂肪酸则通过过氧化物酶增殖物激活受体（PPAR）通路促进M2型极化。因此，脂质代谢在骨稳态中的巨噬细胞极化过程中扮演了重要角色。

在脂质代谢相关的研究中，传统的检测方法主要依赖于血液中的脂质物质，如总胆固醇（TC）、甘油三酯（TGs）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的测定。然而，这些方法往往无法满足对特定分子指标进行实时和原位检测的需求。因此，研究者们开始探索更精准的分子和酶指标，其中CarE因其在脂质代谢、内源性生成、药物消化和外源性毒物摄入中的关键作用而受到关注。CarE作为调节脂质代谢的重要酶，其活性水平的变化与多种疾病状态密切相关，包括肝病、肥胖相关炎症性疾病等。

为了更有效地检测CarE在巨噬细胞极化中的作用，科学家们设计并合成了一种基于香草醛-吡啶-咪唑核心结构的荧光探针VanPI-CarE。该探针在溶液系统中表现出显著的荧光增强特性，当受到CarE作用时，其在355纳米波长激发下，在490纳米波长处产生明显的荧光信号。这一特性使得VanPI-CarE能够在复杂的生物环境中，实现对CarE的高灵敏度检测。同时，该探针在不同pH值、反应时间和温度条件下表现出良好的稳定性和选择性，能够适应生理和病理条件下的检测需求。

实验结果显示，VanPI-CarE在溶液系统中对CarE的检测具有较高的灵敏度，其检测限（LOD）为0.017 U/mL，表明其在低浓度CarE检测中具有显著优势。此外，该探针对其他竞争性物质（如碱性磷酸酶、天门冬氨酸氨基转移酶、溶菌酶等）表现出极高的选择性，未在这些物质中观察到明显的荧光信号增强。这一结果进一步验证了VanPI-CarE在复杂生物系统中对CarE的特异性识别能力。同时，通过细胞毒性测试，研究人员发现VanPI-CarE在活细胞成像过程中表现出较低的细胞毒性，能够在不影响细胞正常生理功能的情况下，用于监测CarE在巨噬细胞中的表达水平。

为了验证该探针在活细胞中的应用效果，研究团队选择了RAW264.7和MC3T3-E1两种细胞系进行实验。这两种细胞系分别代表巨噬细胞和成骨细胞前体，能够模拟骨稳态中的细胞行为。通过MTT实验，研究人员发现即使在50微摩尔的高浓度下，VanPI-CarE仍能保持细胞的高存活率，表明其具有良好的生物相容性。随后，研究团队使用共聚焦显微镜对不同处理条件下的细胞进行了成像分析。结果显示，VanPI-CarE能够清晰地检测到巨噬细胞中CarE的水平变化，并且在不同的诱导和抑制条件下，其荧光信号具有显著差异。例如，在BNPP（一种CarE抑制剂）处理的细胞中，荧光信号明显减弱，而在ox-LDL（一种诱导CarE表达的物质）处理的细胞中，荧光信号显著增强。这些结果表明，VanPI-CarE能够有效反映CarE在巨噬细胞极化过程中的动态变化。

此外，研究团队还测试了RANKL（一种促进巨噬细胞极化为M1型的因子）和Denosumab（一种RANKL抑制剂）对CarE水平的影响。在RANKL诱导的细胞中，VanPI-CarE的荧光信号显著降低，而在Denosumab处理的细胞中，荧光信号逐渐恢复至原始状态。这表明VanPI-CarE不仅能够检测CarE的水平变化，还能反映巨噬细胞极化过程中的代谢调控机制。通过这一探针，研究人员可以更直观地观察到巨噬细胞在骨稳态中的极化状态，并进一步探讨其与炎症反应之间的关系。

VanPI-CarE的开发为研究巨噬细胞极化提供了新的工具。传统的CarE检测方法通常需要离体操作，而该探针能够在活细胞中实现非侵入性的荧光成像，从而更准确地反映细胞内的动态变化。这种能力对于研究炎症相关疾病的机制具有重要意义，因为它可以实时监测CarE在细胞内的变化，并结合其他分子指标（如血钙浓度和细胞因子）构建更全面的检测网络。此外，VanPI-CarE的高选择性和低细胞毒性使其适用于多种生物样本，包括组织切片和活体成像，为未来的临床研究和药物开发提供了新的思路。

综上所述，VanPI-CarE的开发不仅拓展了荧光探针在CarE检测中的应用范围，还为研究骨稳态中巨噬细胞极化与炎症之间的关系提供了重要的实验依据。该探针在溶液系统和活细胞成像中的优异表现，表明其在生物医学研究中的广泛应用前景。未来的研究可以进一步优化该探针的荧光信号强度，提高其在活体成像中的灵敏度和分辨率，从而更好地应用于疾病诊断和治疗监测。