基于microRNA介导的基因沉默技术的CAR-T细胞多重工程化：一种规避DNA双链断裂风险的新型治疗策略

本文创新性地采用优化的microRNA（miRNA）骨架mirGE实现CAR-T细胞的多重基因沉默，靶向T细胞受体（TCR）和主要组织相容性复合体I类（MHC-I），避免了CRISPR/Cas9基因编辑导致的DNA双链断裂风险。研究证明，沉默型（S）M5CAR-T细胞在胰腺导管腺癌（PDAC）模型中展现出与敲除型（KO）细胞相当的抗肿瘤活性，且具有更优的体内持久性、转移抑制能力和对同种异体NK细胞的抵抗性，为通用型CAR-T疗法开发提供了新思路。

　　

背景

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法面临多重挑战，包括DNA双链断裂的致癌风险。研究团队提出利用优化的microRNA（miRNA）骨架mirGE实现多重基因沉默，靶向T细胞受体（TCR）的CD3ζ亚基和主要组织相容性复合体I类（MHC-I）的β₂微球蛋白（β₂M），以开发更安全的通用型CAR-T细胞。

方法

通过设计靶向CD3ζ和β₂M的miRNA序列（CD3ζ_T1/T2和β₂M_T5），将其克隆至携带M5CAR（靶向间皮素）的双向启动子慢病毒载体。与CRISPR/Cas9敲除（KO）技术对比，评估了沉默型（S）M5CAR-T细胞的抗肿瘤功能、体内持久性及免疫逃逸能力。

结果

1. 1.

   制造优势：S细胞扩增倍数达96±30.4，显著高于KO细胞（14.8±7.4），且保持更优的中央记忆（CM）表型（CD45RO⁺CCR7⁺）。

2. 2.

   功能验证：S细胞实现CD3ζ沉默效率91.1±6.7%，β₂M沉默67.7±9.3%，体外杀伤活性与KO细胞相当。

3. 3.

   体内表现：在PDAC小鼠模型中，S细胞较KO细胞显著降低转移发生率（16.7% vs 56.3%），且外周血持久性提升3倍。

4. 4.

   免疫调节：保留部分MHC-I表达的S细胞对同种异体NK细胞的抵抗性优于KO细胞（存活率提高40%），同时有效抑制PBMC增殖。

讨论

该研究首次证实mirGE介导的多重沉默可替代基因编辑，其优势包括：

• •

  单次慢病毒转导实现CAR与沉默元件共表达

• •

  可调控的MHC-I沉默避免"缺失自我"反应

• •

  规避染色体易位等基因组风险

  未来可扩展至TOX等耗竭相关基因的精准调控，为实体瘤治疗提供新范式。

创新价值

通过"沉默而非删除"的策略，该技术为通用型CAR-T开发提供了兼具安全性、可扩展性和功能可调性的工程化平台，已展示出明确的临床转化潜力。